1. شروعاتي سمجھ
هن مرحلي تي، اسان کي ڪجهه مفهومن ۽ اصطلاحن کي سمجهڻ جي ضرورت آهي، جيئن اسان جي بزرگن جي سامهون غلطي ڪرڻ کان بچڻ لاء، جهڙوڪ:
سوال: RT-PCR، qPCR، ريئل ٽائيم پي سي آر، ۽ ريئل ٽائيم RT-PCR جي وچ ۾ ڇا فرق آهي؟
جواب: RT-PCR آهي ريورس ٽرانسڪرپشن PCR(ريورس ٽرانسڪرپشن PCR، RT-PCR)، جيڪو وڏي پيماني تي استعمال ٿيل مختلف قسم جي پوليميرس چين جي رد عمل (PCR) آهي.RT-PCR ۾، هڪ آر اين اي اسٽرينڊ کي مڪمل ڪندڙ ڊي اين اي ۾ ريورس نقل ڪيو ويندو آهي، جيڪو پوءِ پي سي آر پاران ڊي اين اي ايمپليفڪيشن لاءِ ٽيمپليٽ طور استعمال ڪيو ويندو آهي.
حقيقي وقت-PCR ۽ qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) ساڳي شيءِ آهن، ٻئي حقيقي وقت مقداري PCR آهن، جنهن جو مطلب آهي ته PCR جي هر چڪر ۾ حقيقي وقت جي ڊيٽا جا رڪارڊ هوندا آهن، تنهنڪري شروعاتي ٽيمپليٽس جو تعداد درست تجزيو ڪري ترتيب ڏئي سگهجي ٿو.
جيتوڻيڪ ٻئي ريئل ٽائم پي سي آر (ريئل ٽائيم فلورسنٽ مقداري پي سي آر) ۽ ريورس ٽرانسڪرپشن پي سي آر (ريورس ٽرانسڪرپشن پي سي آر) کي RT-PCR طور مختصر ڪيو وڃي ٿو، بين الاقوامي ڪنوينشن آهي: RT-PCR خاص طور تي ريورس ٽرانسپشن ڏانهن اشارو ڪري ٿو.پي سي آر، حقيقي وقت جي پي سي آر کي عام طور تي مختصر ڪيو ويندو آهي qPCR (مقدار واري حقيقي وقت پي سي آر).
۽ حقيقي وقت RT-PCR (RT-qPCR)، اهو ريورس ٽرانسپشن پي سي آر آهي جيڪو فلورسنٽ مقدار جي ٽيڪنالاجي سان گڏ آهي.: پهرين حاصل ڪريو سي ڊي اين اي (آر ٽي) آر اين اي ريورس ٽرانسڪرپشن کان، ۽ پوء استعمال ڪريو ريئل ٽائيم پي سي آر مقداري تجزيي لاءِ (qPCR).گهڻيون ليبارٽريون RT-qPCR ڪن ٿيون، يعني RNA ايڪسپريشن ڊائون ريگيوليشن تي تحقيق، تنهن ڪري qPCR جنهن بابت هرڪو ليبارٽري ۾ ڳالهائي ٿو اهو اصل ۾ RT-qPCR ڏانهن اشارو ڪري ٿو، پر اهو نه وساريو ته اڃا تائين ڪلينڪل ايپليڪيشنن ۾ ڪيترائي ڊي اين اي ٽيسٽ آهن.مقدار جي تجزيو، جهڙوڪ هيپاٽائيٽس بي وائرس HBV جي سڃاڻپ.
سوال: فلورسنٽ مقداري پي سي آر جي تمام گھڻي پڙهڻ کان پوءِ، 80-300bp جي رينج اندر ايمپليفائيڊ فريگمينٽ کي ڇو ڪنٽرول ڪيو وڃي؟
جواب: هر جين جي ترتيب جي ڊيگهه مختلف آهي، ڪجهه ڪيترائي kb آهن، ڪجهه سوين بي پي آهن، پر اسان کي ضرورت آهي ته پراڊڪٽ جي ڊيگهه 80-300bp هجي جڏهن پرائمر ٺاهيو وڃي، تمام ننڍو يا تمام ڊگهو فلورسنٽ مقداري PCR جي چڪاس لاءِ مناسب نه آهن.پراڊڪٽ جو ٽڪرو پرائمر-ڊيمر کان ڌار ٿيڻ لاءِ تمام ننڍو آهي.پرائمر-ڊائمر جي ڊيگهه اٽڪل 30-40bp آهي، ۽ اهو فرق ڪرڻ ڏکيو آهي ته اهو هڪ پرائمر-ڊائمر آهي يا هڪ پيداوار جيڪڏهن اهو 80bp کان گهٽ آهي.جيڪڏهن پيداوار جو ٽڪرو تمام ڊگهو آهي، 300bp کان وڌيڪ آهي، اهو آسانيء سان گهٽ وڌائڻ واري ڪارڪردگي کي وڌائيندو ۽ جين جي مقدار کي مؤثر طور تي ڳولي نه سگهندو.
مثال طور، جڏهن توهان ڳڻيو ته ڪلاس روم ۾ ڪيترا ماڻهو آهن، توهان کي صرف ڳڻڻ جي ضرورت آهي ته ڪيترا وات آهن.ساڳيو ئي سچ آهي جڏهن توهان جين کي ڳوليندا آهيو، توهان کي صرف هڪ جين جي هڪ خاص ترتيب کي ڳولڻ جي ضرورت آهي جنهن جي نمائندگي ڪرڻ لاء مڪمل تسلسل ڪندو.جيڪڏھن توھان ماڻھن کي ڳڻڻ چاھيو ٿا، توھان کي وات ۽ نڪ، ڪن ۽ چشمن کي ڳڻڻ گھرجي، ۽ غلطي ڪرڻ آسان آھي.
وسعت ڏيڻ لاءِ، حياتياتي تحقيق ۾، نقطي کان وٺي علائقي تائين ڪيترائي تحقيقي ڪيس آهن، ڇاڪاڻ ته ڪنهن به ذات جي جين جو سلسلو تمام ڊگهو هوندو آهي، ان ڪري سڀني ٽڪرن کي ماپڻ غير ضروري ۽ ناممڪن هوندو آهي، جهڙوڪ بيڪٽيريا 16S سيڪوئنسنگ، جيڪو بيڪٽيريا جي قدامت پسند تسلسل کي انجام ڏيڻ لاءِ هڪ مخصوص آباديءَ جو اندازو لڳائيندو آهي.
عبرت: qPCR پرائمر ڊيزائن لاء بهترين ڊيگهه ڇا آهي؟
جواب: عام طور تي ڳالهائڻ، پرائمر جي ڊيگهه اٽڪل 20-24bp آهي، جيڪو بهتر آهي.يقينن، اسان کي پرائمر جي TM قدر تي ڌيان ڏيڻ گهرجي جڏهن پرائمر کي ڊزائين ڪيو وڃي، ڇاڪاڻ ته اهو بهترين اينيلنگ گرمي سان لاڳاپيل آهي.ڪيترن ئي تجربن کان پوء، اهو ثابت ڪيو ويو آهي ته 60 ° C هڪ بهتر TM قدر آهي.جيڪڏهن annealing گرمي پد تمام گهٽ آهي، ان کي آساني سان غير مخصوص amplification جي اڳواڻي ڪندو.جيڪڏهن annealing گرمي پد تمام گهڻو آهي، amplification ڪارڪردگي نسبتا گهٽ ٿيندو، amplification وکر جي چوٽي بعد ۾ شروع ٿيندي، ۽ CT قدر دير ٿي ويندي.
عبرت: رنگ جو طريقو تحقيق جي طريقي کان ڪيئن مختلف آهي؟
جواب: رنگ جو طريقوڪجھ فلورسنٽ رنگ، جھڙوڪ SYBR Green Ⅰ، PicoGreen، BEBO، وغيره، پاڻ ۾ روشني خارج نه ڪندا آھن، پر ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي جي نابالغ نالن سان پابند ٿيڻ کان پوءِ فلوروسينس خارج ڪندا آھن.تنهن ڪري، PCR ردعمل جي شروعات ۾، مشين فلورسنٽ سگنل کي ڳولي نه ٿو سگهي.جڏهن رد عمل annealing-extension اسٽيج تي پهچندو آهي، ته ڊبل اسٽرينڊ کوليو ويندو آهي، ۽ هڪ نئون اسٽرينڊ DNA پوليميرس جي عمل هيٺ ٺهندو آهي، ۽ فلورسنٽ ماليڪيول dsDNA مائنر گروو سان جڙيل هوندو آهي.جيئن ته PCR سائيڪلن جو تعداد وڌي ٿو، وڌيڪ ۽ وڌيڪ رنگ ڊبل-اسٽرينڊ ڊي اين اي سان گڏ ڪيا ويا آهن، ۽ فلورسنٽ سگنل پڻ مسلسل وڌايو ويندو آهي.رنگ جو طريقو خاص طور تي سائنسي تحقيق ۾ استعمال ٿيندو آهي.
پي ايس: تجربو ڪرڻ وقت محتاط رهو، رنگ کي انساني ڊي اين اي سان ملائڻو پوندو، محتاط رھو ته ان کي فلورسنٽ شخص ۾ تبديل ڪيو وڃي.
رنگ جو طريقو (کاٻي) تحقيق جو طريقو (ساڄي)
پي ايس: تجربو ڪرڻ وقت محتاط رهو، رنگ کي انساني ڊي اين اي سان ملائڻو پوندو، محتاط رھو ته ان کي فلورسنٽ شخص ۾ تبديل ڪيو وڃي.
SYBR گرين Ⅰ ڊي اين اي جي ننڍڙي نالي سان جڙيل آهي
تحقيق جو طريقوTaqman تحقيق سڀ کان عام استعمال ٿيل hydrolysis تحقيق آهي.تحقيق جي 5′ پڇاڙيءَ ۾ هڪ فلورسنٽ گروپ هوندو آهي، عام طور تي FAM، ۽ پروب بذات خود ٽارگيٽ جين جو پورو پورو سلسلو آهي.3′ آخر ۾ هڪ فلورسنٽ quenching گروپ آهي.fluorescence resonance energy transfer (Förster resonance energy transfer, FRET) جي اصول موجب، جڏهن رپورٽر فلورسنٽ گروپ (ڊونر فلورسنٽ ماليڪيول) ۽ quenching fluorescent گروپ (قبول ڪندڙ fluorescent ماليڪيول) پرجوش ٿين ٿا، جڏهن اسپيڪٽرا اوورليپ ٿئي ٿو ۽ فاصلو تمام گهڻو ويجهو ٿي سگهي ٿو. قبول ڪندڙ ماليڪيول جو fluorescence، جڏهن ته autofluorescence ڪمزور آهي.تنهن ڪري، PCR ردعمل جي شروعات ۾، جڏهن تحقيق آزاد آهي ۽ سسٽم ۾ برقرار آهي، رپورٽر فلورسنٽ گروپ فلورسنس کي خارج نه ڪندو.جڏهن annealing، پرائمر ۽ تحقيق ٽيمپليٽ سان پابند.توسيع واري مرحلي دوران، پوليميرس مسلسل نئين زنجيرن کي گڏ ڪري ٿو.ڊي اين اي پوليمريز ۾ 5′-3′ exonuclease سرگرمي آهي.جڏهن جاچ تائين پهچندي، ڊي اين اي پوليميرس ٽيمپليٽ مان جاچ کي هائيڊروائيز ڪندو، رپورٽر فلورسنٽ گروپ کي ڪوينچر فلورسنٽ گروپ کان الڳ ڪندو، ۽ فلورسنٽ سگنل جاري ڪندو.جيئن ته پروب ۽ ٽيمپليٽ جي وچ ۾ هڪ کان هڪ تعلق آهي، جاچ جو طريقو، ٽيسٽ جي درستگي ۽ حساسيت جي لحاظ کان رنگ جي طريقي کان بهتر آهي.تحقيق جو طريقو خاص طور تي تشخيص ۾ استعمال ٿيندو آهي.
سوال: مطلق مقدار ڇا آهي؟نسبتي مقدار ڇا آهي؟
جواب: مطلق مقدار جو مطلب qPCR پاران جانچڻ لاءِ نموني جي ابتدائي ڪاپي نمبر جي حساب سان، جيئن ته ڪيترا HBV وائرس رت جي 1ml ۾ آهن.لاڳاپي جي مقدار جي ذريعي حاصل ڪيل نتيجو هڪ مخصوص نموني ۾ ٽارگيٽ جين جي مقدار ۾ هڪ ٻئي حوالي جي نموني جي نسبت ۾ تبديلي آهي، ۽ جين جو اظهار اپ-منظم يا هيٺيون ضابطو آهي.
سوال: ڇا آر اين اي ڪڍڻ جي مقدار، ريورس ٽرانسپشن ڪارڪردگي، ۽ ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي تجرباتي نتيجن کي متاثر ڪندي؟
سوال: ڇا نمونن جي اسٽوريج، ايڪسٽريشن ريجنٽس، ريورس ٽرانسپشن ريجنٽس، ۽ روشنيءَ جي منتقلي استعمال ٿيندڙ سامان تجرباتي نتيجن کي متاثر ڪندا؟
سوال: ڪهڙو طريقو تجرباتي ڊيٽا کي درست ڪري سگهي ٿو؟
انهن مسئلن جي حوالي سان، اسان انهن کي تفصيل سان بيان ڪنداسين هيٺ ڏنل ترقي يافته حصن ۾.
2. اعليٰ علم
حقيقي وقت ۾ فلورسنٽ مقداري پي سي آر جي حوالي سان، اسان کي حقيقت کي سمجهڻ گهرجي ته هر سال هزارين سائنسي تحقيقي مقالا شايع ٿيندا آهن، جن ۾ فلورسنٽ مقداري پي سي آر ٽيڪنالاجي جو تعداد ننڍڙو ناهي.
جيڪڏهن فلورسنٽ مقداري پي سي آر جي تجربن کي ماپڻ لاءِ ڪو عام معيار نه آهي، ته نتيجا مختلف ٿي سگهن ٿا.ساڳئي نسل جي ساڳئي جين لاء، ساڳئي پروسيسنگ طريقي سان، ڳولڻ جا نتيجا به وڏي پيماني تي مختلف هوندا، ۽ دير سان اچڻ وارن لاءِ ساڳئي نتيجن کي ورجائڻ ڏکيو هوندو.توهان کي خبر ناهي ته ڪير صحيح آهي ۽ ڪهڙو غلط آهي.
ڇا ان جو مطلب اهو آهي ته فلورسنٽ مقداري پي سي آر هڪ چيٽ ٽيڪنالاجي آهي يا هڪ ناقابل اعتبار ٽيڪنالاجي؟نه، اهو ئي سبب آهي ته فلورسنٽ مقداري پي سي آر وڌيڪ حساس ۽ وڌيڪ صحيح آهي، ۽ ٿورو غلط آپريشن مڪمل طور تي مخالف نتيجا پيدا ڪندو.هڪ ننڍڙو نقصان هڪ هزار ميل پري آهي.مضمون جي ليکڪ کي بار بار نظر ثاني ڪندڙن پاران تشدد ڪيو ويندو.ساڳئي وقت، جرنل جي نظرثاني ڪندڙ پڻ مختلف تجرباتي نتيجن مان چونڊڻ ڏکيو آهي.
مجموعي طور تي، حقيقي وقت جي پي سي آر تجربن ۾ اتفاق جي کوٽ ڏانهن اشارو ڪندي.انهي جي پڇاڙيء ۾، صنعت ۾ سينئر سائنسدان معيار کي ترتيب ڏيڻ شروع ڪيو،انهن معيارن کي پورا ڪرڻ لاءِ مضمون ۾ ڪجهه ضروري تجرباتي ۽ ڊيٽا پروسيسنگ تفصيل (ضروري ڊيٽا سميت) مهيا ڪرڻ لاءِ حصو وٺندڙن کي گهربل آهي.
نظرثاني ڪندڙ انهن تفصيلن کي پڙهڻ سان تجربي جي معيار جو اندازو لڳائي سگهن ٿا؛مستقبل جا پڙهندڙ به هن کي استعمال ڪري سگھن ٿا تجربو ٻيهر ورجائڻ يا تجربي کي بهتر ڪرڻ لاءِ.پوءِ ان طريقي سان حاصل ڪيل تجرباتي نتيجا معلومات سان ڀرپور، اعليٰ معيار ۽ قابل استعمال هوندا آهن.
MIBBI (گهٽ ۾ گهٽ معلومات حياتياتي ۽ حياتياتي تحقيقات لاءِ -http://www.mibbi.org) وجود ۾ آيو.MIBBI ھڪڙو منصوبو آھي جيڪو تجربن لاء معيار مهيا ڪري ٿو.اهو فطرت ۾ شايع ٿيل آهي.هن پروجيڪٽ جو مقصد مختلف حياتياتي تجربا آهن، جن ۾ سيل جي حياتيات، مائڪرو اري، qPCR جنهن تي اسان هاڻي بحث ڪرڻ وارا آهيون، وغيره، ۽ هر قسم جي تجربن لاءِ مهيا ڪري ٿي جڏهن مسودو جمع ڪرايو وڃي.اها معلومات هر وقت مهيا ڪئي وڃي.
MIBBI منصوبي ۾، فلورسنٽ مقداري پي سي آر سان لاڳاپيل ٻه مضمون آهن، يعني:
· RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) - ھڪ منظم ٻولي ۽ رپورٽنگ ھدايت حقيقي وقت جي مقداري PCR ڊيٽا لاءِ؛
· MIQE (گهٽ ۾ گھٽ معلومات پبليڪيشن آف پبليڪيشن آف ڪوانٽيٽيو ريئل ٽائم پي سي آر تجربن) - ريئل ٽائيم مقداري پي سي آر تجربن بابت آرٽيڪل شايع ڪرڻ لاءِ گھٽ ۾ گھٽ معلومات.
پهرين، اچو ته RDML بابت ڳالهايون، اصطلاحن جي وضاحت.
جيڪڏهن هر شيءِ لاءِ معياري وصف نه آهي، ته بحث جاري رکڻ ناممڪن آهي، ڇو ته امتحان ۾ اصطلاحن جي وضاحت تمام ضروري آهي.
فلورسنٽ مقداري پي سي آر جي تجربن ۾ استعمال ڪيل اصطلاحن ۾ ھيٺيون مواد شامل آھي.QIAGEN اسان لاءِ بهترين خلاصو ڪيو آهي.هيٺيون سڀ سڪل آهنسامان .
وڌائڻ وارو وکر
ايمپليفڪيشن وکر PCR جي عمل دوران ٺهيل وکر ڏانهن اشارو ڪري ٿو، سائيڪل نمبر سان abscissa ۽ حقيقي وقت فلوروسينس شدت رد عمل دوران آرڊينيٽ جي طور تي.
هڪ بهترين amplification وکر هيٺ ڏنل خاصيتون هجڻ گهرجي: بيس لائين فليٽ يا ٿورڙي گھٽجي وئي آهي، ۽ ڪو به واضح مٿي وارو رجحان نه آهي؛وکر جو انفليڪشن پوائنٽ واضح آهي، ۽ ايڪسپورنٽيل مرحلي جو سلوپ امپليفڪيشن جي ڪارڪردگيءَ جي متناسب آهي.اوترو وڏو ڍلو، اوترو وڌيڪ وڌائڻ جي ڪارڪردگي؛مجموعي واڌ ويجهه واري وکر متوازيت سٺي آهي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته هر ٽيوب جي ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي هڪجهڙائي آهي؛گھٽ ڪنسنٽريشن جي نمونن جي ايمپليفڪيشن وکر جو واڌارو مرحلو پڌرو آھي.
بيس لائين (بيس لائين)
بيس لائين شروعاتي چڪر جي شور جي سطح آھي، عام طور تي 3rd ۽ 15th چڪر جي وچ ۾ ماپي ويندي آهي، ڇاڪاڻ ته ايمپليفڪيشن پراڊڪٽ جي ڪري فلورسنس قدر ۾ اضافو هن عرصي دوران ڳولي نه ٿو سگهجي.بيس لائين کي ڳڻڻ لاء استعمال ڪيل چڪر جو تعداد مختلف ٿي سگھي ٿو ۽ ٿي سگھي ٿو گھٽائڻ جي ضرورت آھي جيڪڏھن اعلي ٽيمپليٽ مقدار استعمال ڪيا وڃن يا جيڪڏھن ھدف جين جي اظهار جي سطح اعلي آھي.
بيس لائين کي ترتيب ڏيڻ جي ضرورت آهي لڪيريت ايمپليفڪيشن وکر مان فلورسنس ڊيٽا ڏسڻ.بيس لائين سيٽ ڪئي وئي آهي ته جيئن ايمپليفڪيشن وکر جي واڌ هڪ سائيڪل نمبر سان شروع ٿئي ٿي بنيادي لائن چڪر جي مٿين نمبر کان وڌيڪ.بنيادي طور تي هر ٽارگيٽ جي ترتيب لاءِ انفرادي طور تي مقرر ٿيڻ گهرجن.ابتدائي چڪرن ۾ معلوم ڪيل اوسط فلوروسينس قدرن کي وڌائڻ جي ضرورت آهي فلوروسينس قدرن مان حاصل ڪيل پروڊڪٽس ۾ حاصل ڪيل.مختلف ريئل ٽائم پي سي آر سافٽ ويئر جا جديد ورجن انفرادي نموني لاءِ بيس لائين سيٽنگن جي خودڪار اصلاح جي اجازت ڏين ٿا.
PCR amplification جي رد عمل جي پهرين ڪجھ چڪر دوران، فلورسنس سگنل گهڻو تبديل نٿو ڪري.هڪ سڌي لڪير جي ويجهو اچڻ کي بيس لائين چئبو آهي، پر جيڪڏهن اسان پهرين ڪجهه چڪرن کي ويجهي نظر سان ڏسندا آهيون، اسان ڏسون ٿا ته هيٺ ڏنل تصوير ۾ بيس لائين جي اندر ڇا ٿي رهيو آهي.
پس منظر پس منظر مان مراد
رد عمل ۾ غير مخصوص فلورسنس قدر.مثال طور: غير موثر fluorescence quenching؛يا SYBR گرين جي استعمال جي ڪري ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي ٽيمپليٽس جو وڏو تعداد.سگنل جي پس منظر جي اجزاء کي رياضياتي طور تي هٽايو ويو آهي ريئل ٽائم پي سي آر سافٽ ويئر الگورتھم.
رپورٽر سگنل
رپورٽر سگنل SYBR گرين پاران تيار ڪيل فلورسنٽ سگنل ڏانهن اشارو ڪري ٿو يا ريئل ٽائم پي سي آر دوران فلورسنٽ طور تي ليبل ٿيل ترتيب-مخصوص پروبس.
عام رپورٽر سگنل (RN)
RN هر چڪر تي ماپيل غير فعال ريفرنس ڊائي جي فلوروسينس شدت سان ورهايل رپورٽر رنگ جي فلوروسينس شدت ڏانهن اشارو ڪري ٿو.
غير فعال حوالو رنگ
ڪجھ حقيقي وقت پي سي آر ۾،فلورسنٽ ڊائي ROX فلورسنٽ سگنل کي معمول ڪرڻ لاءِ اندروني حوالي طور استعمال ڪيو ويندو آهي.اهو غلط پائپنگ، سٺي پوزيشن، ۽ چڱي طرح جي بنياد تي فلورسنس جي وهڪري جي ڪري تبديلين لاء درست ڪري ٿو.
فلورسنس جي حد (حد)
پس منظر جي قيمت کان مٿي ترتيب ڏني وئي ۽ نمايان طور تي ايمپليفڪيشن وکر جي پليٽي قدر هيٺ.اهو لازمي طور تي ايمپليفڪيشن وکر جي لڪير واري علائقي ۾ هجڻ گهرجي، پي سي آر ڳولڻ جي لاگ-لينر رينج جي نمائندگي ڪري ٿو.حدن کي لاگ-ايمپليفڪيشن وکر جي ڏيک ۾ مقرر ڪيو وڃي ته جيئن PCR جو لاگ-لينر مرحلو آساني سان سڃاڻي سگهجي.جيڪڏهن ريئل ٽائيم پي سي آر ۾ ڪيترائي ٽارگيٽ جينس آهن، ته هر ٽارگيٽ لاءِ حد مقرر ٿيڻ گهرجي.عام طور تي، پي سي آر جي رد عمل جي پهرين 15 چڪر جي فلورسنس سگنل کي فلوروسينس پس منظر سگنل طور استعمال ڪيو ويندو آهي، ۽ فلوروسينس حد PCR جي پهرين 3 کان 15 سائيڪلن جي فلوروسينس سگنل جي معياري انحراف کان 10 ڀيرا آهي، ۽ فلوروسينس حد PCR جي ايڪسپونٽيل مرحلي ۾ مقرر ڪئي وئي آهي.عام طور تي، هر اوزار کي استعمال ڪرڻ کان پهريان ان جي فلورسنس حد مقرر ڪئي وئي آهي.
سائيڪل جي حد (CT) يا ڪراسنگ پوائنٽ (CP)
اهو چڪر جنهن تي ايمپليفڪيشن وکر حد کي پار ڪري ٿو (يعني، اهو نقطو جنهن تي فلورسنس جي سڃاڻپ خاص طور تي وڌي ٿي).CT ھڪڙو حصو ٿي سگھي ٿو ۽ شروعاتي ٽيمپليٽ جو مقدار حساب ڪري سگھجي ٿو.CT قدر ھر ھڪڙي پي سي آر جي رد عمل واري ٽيوب ۾ فلورسنٽ سگنل کي مقرر ڪيل حد تائين پھچندي آھي تجربو ڪيل چڪر جي تعداد جي نمائندگي ڪري ٿو.هر ٽيمپليٽ جي CT قدر ۽ ٽيمپليٽ جي شروعاتي ڪاپي نمبر جي لوگارٿم جي وچ ۾ هڪ لڪير وارو تعلق آهي،ابتدائي ڪاپي نمبر کان وڌيڪ، CT قدر ننڍو، ۽ ان جي برعڪس.ھڪڙي معياري وکر ھڪڙي معياري استعمال ڪندي سڃاتل ابتدائي ڪاپي نمبر سان ٺاھي سگھجي ٿو، جنھن ۾ abscissa CT قدر جي نمائندگي ڪري ٿو، ۽ ordinate ابتدائي ڪاپي نمبر جي لاگارٿم جي نمائندگي ڪري ٿو.تنهن ڪري، جيستائين اڻڄاتل نموني جي CT قدر حاصل ڪئي وڃي، نموني جي شروعاتي ڪاپي نمبر کي معياري وکر مان شمار ڪري سگهجي ٿو.
ΔCT قدر
ΔCT قدر بيان ڪري ٿوھدف جي جين جي وچ ۾ فرق ۽ لاڳاپيل endogenous حوالو جين CT قدر، جيئن گھر جي سنڀال جي جين، ۽ استعمال ٿيل ٽيمپليٽ جي مقدار کي عام ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آھي:
⇒ΔCT = CT (ٽارگٽ جين) - CT (انڊوجينس ريفرنس جين)
ΔΔCT قدر
ΔΔCT قدر بيان ڪري ٿو ΔΔCT قدر جي وچ ۾ فرق جي وچ ۾ دلچسپي جي نموني (مثال طور، حوصلہ افزائي سيلز) ۽ مطلب ΔΔCT قدر ھڪڙو حوالو نموني جي (مثال طور، غير متحرڪ سيلز).حوالن جي نموني کي پڻ حساب ڪتاب جو نمونو سڏيو ويندو آهي ۽ ٻيا سڀئي نمونا ان لاءِ عام ڪيا ويا آهن نسبتا quantification لاءِ:
⇒ΔΔCT = اوسط ΔCT (دلچسپي جو نمونو) - اوسط ΔCT (حوالو نموني)
Endogenous Reference genes (Endogenous Reference genes)
اندروني حوالن جين جي اظهار جي سطح، جهڙوڪ هائوس ڪيپنگ جينز (گهر جي سنڀال جين)، نموني جي وچ ۾ فرق نه آهي.حوالو جين جي CT قدرن جي مقابلي ۾ ٽارگيٽ جين کي ٽارگيٽ جين جي اظهار جي سطح کي ان پٽ آر اين اي يا سي ڊي اين جي مقدار کي عام ڪرڻ جي اجازت ڏئي ٿي (مٿي ڏنل ΔCT قدرن تي سيڪشن ڏسو).
اندروني حوالن جين لاء صحيحممڪن آر اين اي جي تباهي يا آر اين اي نموني ۾ اينزيم انابيٽرز جي موجودگي، انهي سان گڏ آر اين اي مواد ۾ مختلف تبديليون، ريورس ٽرانسڪرپشن ڪارڪردگي، نيوڪليڪ ايسڊ جي بحالي، ۽ نموني سنڀالڻ.بھترين حوالن جين (جين) کي چونڊڻ لاءِ، اسان الورورٿم کي تبديل ڪيو آھي ان جي چونڊ جي اجازت ڏيڻ لاءِ بھترين حوالن جو انحصار تجرباتي سيٽنگ تي.
اندروني ضابطو
هڪ ڪنٽرول تسلسل جيڪو ساڳيو رد عمل ۾ وڌايو ويو آهي ٽارگيٽ ترتيب جي طور تي ۽ مختلف تحقيق سان جانچيو ويو آهي (يعني ڊپلڪس پي سي آر کي انجام ڏيڻ).اندروني ڪنٽرول اڪثر ڪري استعمال ڪيا ويندا آھن ناڪامي تي ضابطو آڻڻ لاءِ، جھڙوڪ جڏھن ھدف جي ترتيب معلوم نه ٿئي.
حساب ڪتاب جو نمونو
ھڪڙو حوالو نمونو (مثال طور، ھڪڙي سيل لائن يا ٽشو مان صاف ٿيل آر اين اي) ھڪڙي جين جي لاڳاپي جي اظهار جي سطح کي طئي ڪرڻ لاء ٻين سڀني نمونن جي مقابلي لاء نسبتي مقدار ۾ استعمال ڪيو ويو آھي.حساب ڪتاب جو نمونو ڪو به نمونو ٿي سگهي ٿو، پر عام طور تي هڪ ڪنٽرول هوندو آهي (مثال طور، هڪ غير علاج ٿيل نمونو يا تجربو جي وقت صفر کان هڪ نمونو).
مثبت ڪنٽرول
سان گڏ ڪنٽرول ردعمل استعمال ڪريوٽيمپليٽ جي معلوم مقدار.مثبت ڪنٽرول اڪثر استعمال ڪيا ويندا آهن چيڪ ڪرڻ لاءِ ته هڪ پرائمر سيٽ يا پرائمر-پروب سيٽ صحيح طريقي سان ڪم ڪري رهيو آهي ۽ اهو رد عمل صحيح طرح سان ترتيب ڏنل آهي.
ڪابه ٽيمپليٽ ڪنٽرول (NTC)
هڪ ڪنٽرول ردعمل جنهن ۾ ايمپليفڪيشن ردعمل جي سڀني ضروري اجزاء شامل آهن سواء ٽيمپليٽ، جيڪو عام طور تي پاڻي سان تبديل ڪيو ويندو آهي.اين ٽي سي جو استعمال ريٽيجنٽ آلودگي يا غير ملڪي ڊي اين اي جي سبب آلودگي کي ڳولي سگھي ٿو، اهڙيء طرح تشخيص ڊيٽا جي صداقت ۽ اعتبار کي يقيني بڻائي ٿي.اين ٽي سي ڪنٽرول جي واڌارو آلودگي کي ظاهر ڪري ٿو.
ڪوبه آر ٽي ڪنٽرول (NRT)
آر اين اي ڪڍڻ واري عمل ۾ بقايا جينومڪ ڊي اين اي شامل ٿي سگھي ٿو، جيڪو انتهائي نقصانڪار آهي ۽ اهو مجرم آهي جيڪو ڊيٽا جي معيار کي متاثر ڪري ٿو ۽ qPCR جو قدرتي دشمن آهي، تنهن ڪري جڏهن تجربن کي ڊزائين ڪيو وڃي، اهو صرف آر اين اي جي چڪاس کي وڌائڻ لاءِ ٺاهيو وڃي.ان جا ٻه طريقا آهن، هڪ اهو آهي ته پرائمر کي اندروني طور تي ڊزائين ڪرڻ، ٻيو اهو آهي ته مڪمل طور تي ڊي اين اي کي هٽائڻ، ڪهڙو بهتر آهي، جنهن تي بعد ۾ بحث ڪيو ويندو.NTR ڪنٽرول ڊي اين اي آلودگي کي ڳولڻ لاء هڪ جادو آئيني آهي.جيڪڏهن اتي واڌارو آهي، ان جو مطلب آهي آلودگي آهي.
معيار
معيار معلوم ڪنسنٽريشن يا ڪاپي نمبر جا نمونا آھن جيڪي معياري وکر ٺاھڻ لاءِ استعمال ٿين ٿا.معيار جي استحڪام کي يقيني بڻائڻ لاء، جين جو ٽڪرو عام طور تي پلاسميڊ ۾ ڪلون ڪيو ويندو آهي ۽ معياري طور استعمال ڪيو ويندو آهي.
معياري وکر
عام طور تي گھٽ ۾ گھٽ 5 ڪنسنٽريشن گريڊيئنٽس ۾ ملائي ويندي آھي معياري پراڊڪٽ سان ڊبلنگ ريشو جي مطابق، ۽ 5 پوائنٽون ٺاھيا ويندا آھن CT ويلو ۽ ڪاپي نمبر جي ڪوآرڊينيٽس ۾، ۽ پوائنٽس ھڪ معياري وکر ٺاھڻ لاءِ ھڪ ليڪ ٺاھڻ لاءِ ڳنڍيل آھن.هر معياري وکر لاء، ان جي صحيحيت کي جانچڻ جي ضرورت آهي.سلپ جو قدر -3.3 ۽ -3.8 جي وچ ۾ ٿئي ٿو، ۽ هر ڪنسنٽريشن ٽنهي صورتن ۾ ڪيو ويندو آهي.پوائنٽون جيڪي خاص طور تي ٻين نقطن کان مختلف آهن انهن کي رد ڪيو وڃي.نموني جي CT قدر کي جانچيو وڃي ٿو معياري وکر ۾، ۽ نموني جي اظهار جي سطح کي جانچيو وڃي ٿو حساب ڪري سگهجي ٿو.
ٽيسٽ ٿيڻ واري نموني جي CT قيمت کي معياري وکر ۾ آندو ويو آهي، ۽ نموني جي شروعاتي ڪاپي نمبر کي جانچيو وڃي ٿو.
ڪارڪردگي ۽ سلپ
معياري وکر جي سلپ حقيقي وقت جي پي سي آر جي ڪارڪردگي جي نمائندگي ڪري ٿي.
-3.322 جو هڪ سلپ ظاهر ڪري ٿو ته پي سي آر ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي 1، يا 100٪ ڪارائتو آهي، ۽ PCR پراڊڪٽ جو مقدار هر چڪر تي ٻيڻو ٿئي ٿو.
-3.322 کان گھٽ سلپ (مثال طور -3.8) پي سي آر جي ڪارڪردگي کي ظاهر ڪري ٿو
· -3.322 کان وڏو سلوپ (مثال طور -3.0) اشارو ڪري ٿو ته پي سي آر جي ڪارڪردگي 100٪ کان وڌيڪ آهي، جيڪا حيرت انگيز آهي، ته پي سي آر جو هڪ چڪر ڪيئن وڌائي سگھي ٿو ٻيڻو پيداوار کان وڌيڪ؟اها صورتحال پي سي آر جي رد عمل جي غير لڪير واري مرحلي ۾ ٿيندي آهي، اهو آهي، اتي غير مخصوص امپليشن جو وڏو مقدار آهي.
پگھلڻ وارو وکر
qPCR امپليڪشن مڪمل ٿيڻ کان پوء، پي سي آر جي پيداوار کي گرم ڪيو ويندو آهي.جيئن گرمي پد وڌي ٿو، ڊبل اسٽرينڊ ايمپليفڪيشن پراڊڪٽ آهستي آهستي ڳري ٿو، جنهن جي نتيجي ۾ فلورسنس جي شدت ۾ گهٽتائي اچي ٿي.جڏهن هڪ خاص درجه حرارت (Tm) پهچي وڃي ٿي، مصنوعات جو هڪ وڏو تعداد ڳري ويندو.فلورسنس تيزيء سان گهٽجي ٿو.مختلف پي سي آر پروڊڪٽس ۾ مختلف Tm قدر ۽ مختلف پگھلڻ واري درجه حرارت آهي، انهي ڪري ته پي سي آر جي خاصيت کي سڃاڻي سگهجي ٿو.
پگھلڻ وارو وکر (تخذيل وکر)
پگھلڻ وارو وکر هڪ چوٽي نقشو ٺاهڻ لاءِ نڪتل آهي، جيڪو PCR پراڊڪٽ جي ٽڪرن جي صورتحال کي وڌيڪ سمجهه سان ظاهر ڪري سگهي ٿو.جيئن ته پگھلڻ جي درجه حرارت DNA جي ٽڪري جي Tm قدر آھي، ڪجھ پيٽرولر جيڪي DNA ٽڪرا جي Tm قدر کي متاثر ڪن ٿا، تن جو اندازو لڳائي سگھجي ٿو، جھڙوڪ ٽڪر جي سائيز، GC مواد، وغيره. عام طور تي، اسان جي پرائمر ڊيزائن جي اصولن جي مطابق،وڌايل پيداوار جي ڊيگهه 80-300bp جي حد ۾ آهي، تنهنڪري پگھلڻ جو گرمي پد 80 ° C ۽ 90 ° C جي وچ ۾ هجڻ گهرجي.
پگھلڻ واري وکر جي تعبير: جيڪڏهن صرف مکيه چوٽي 80 ° C-90 ° C جي وچ ۾ ظاهر ٿئي ٿي، ان جو مطلب آهي ته فلوروسنٽ مقداري PCR مڪمل آهي؛جيڪڏهن مکيه چوٽي 80 ° C-90 ° C جي وچ ۾ ظاهر ٿئي ٿي ۽ متفرق چوٽيون 80 ° C کان هيٺ ظاهر ٿين ٿيون، بنيادي طور تي پرائمري ڊائمر سمجهيو ويندو آهي.توهان ان کي حل ڪرڻ لاء annealing گرمي پد وڌائڻ جي ڪوشش ڪري سگهو ٿا؛جيڪڏهن مکيه چوٽي 80 ° C-90 ° C جي وچ ۾ ظاهر ٿئي ٿي، ۽ متفرق چوٽي ٻيهر ظاهر ٿئي ٿي جڏهن گرمي پد وڌي ٿي، اهو بنيادي طور تي سمجهيو ويندو آهي ته ڊي اين اي آلودگي آهي، ۽ ڊي اين اي کي تجربو جي شروعاتي اسٽيج تي هٽائڻ جي ضرورت آهي.
يقينن، اڃا به ڪجهه غير معمولي حالتون آهن، جن کي هڪ هڪ هيٺ ٽوڙيو ويندو.
3. اعليٰ علم
qPCR ڪرڻ لاءِ، مون کي چوڻو پوندو MIQE،گھٽ ۾ گھٽ ڄاڻجي اشاعت لاءمقداريحقيقي وقت PCRتجربا - حقيقي وقت جي مقداري PCR بابت آرٽيڪل شايع ڪرڻ لاءِ گھٽ ۾ گھٽ معلوماتتجرباسڀني جي سمجھ کي آسان ڪرڻ لاء، اسان اهم مواد کي آسان ڪنداسين.
توهان انٽرنيٽ تي MIQE جو اصل متن ڳولهي سگهو ٿا، ۽ سڀ کان اهم شيء اها آهي ته اهو بيان ڪري ٿو.ڊيٽا چيڪ لسٽ جيڪا مهيا ڪرڻ جي ضرورت آهي جڏهن هڪ مضمون شايع ڪيو وڃي .
نظرثاني ڪندڙ انهن تفصيلن کي پڙهڻ سان تجربي جي معيار جو اندازو لڳائي سگهن ٿا؛مستقبل جا پڙهندڙ به هي استعمال ڪري سگھن ٿا تجربا ورجائڻ يا بهتر ڪرڻ لاءِ.
اها ڳالهه نوٽ ڪرڻ جي قابل آهي ته هن لسٽ ۾، هر فهرست جي اهميت کي ترتيب سان E يا D سان نشان لڳايو ويو آهي.هن جو ڇا مطلب آهي؟E: ضروري معلومات (جمع ڪيو وڃي)؛D: گهربل معلومات (جيترو ممڪن طور تي مهيا ڪريو).
MIQE (1) - تجرباتي ڊيزائن
گھڻا ڌاڙيل جن پنھنجي گريجوئيٽ اڀياس کي ختم ڪرڻ کان پوءِ پنھنجو دفاع مڪمل ڪيو آھي، اھي نه ڄاڻندا آھن ته ڪيئن آزاديءَ سان ھڪڙو تجربو ٺاھيو وڃي، پنھنجا نوٽ بڪ کوليا وڃن، ۽ اھي ڪم ڪن جيڪي استاد کين ڪرڻ لاءِ چون ٿا.نتيجي طور، تجرباتي ڊيزائن سخت نه هئي، ۽ ميگزين جي ايڊيٽوريل ڊپارٽمينٽ چيو ته اهي هن تصوير ۽ انهي تصوير کي ٺاهڻ چاهيندا هئا، تنهنڪري انهن اهو ڪم ڪيو.اهڙيءَ طرح ٺٺوليون ٿينديون آهن!
گهر جي ويجهو، تجربو جو پهريون اصول طئي ڪرڻ آهيتجرباتي منطق جي سختي.سڀ کان بنيادي شيء تجرباتي ڊيزائن آهي، ۽ تجرباتي ڊيزائن بابت سڀ کان اهم شيء اهو آهي ته ٽارگيٽ نموني، حوالن جو نمونو (ڪنٽرول)، ۽ ورجائي جو تعداد ڪيئن مقرر ڪيو وڃي، ته جيئن تجرباتي ڊيٽا کي حوالو، موازنہ، ۽ قائل ڪري سگهجي.
ھدف جو نمونونموني ڏانهن اشارو ڪري ٿو جيڪو اسان کي هڪ خاص علاج کان پوء ٽارگيٽ جين کي ڳولڻ جي ضرورت آهي.حوالو نمونياهو نمونو آهي بغير ڪنهن علاج جي، جنهن کي اڪثر ڪري حياتيات ۾ جهنگلي قسم جو حوالو ڏنو ويندو آهي.
تجرباتي نقلتمام اهم آهن.عام طور تي، قائل ڪندڙ نقلن جو تعداد ٽن کان وڌيڪ هجڻ گھرجي.اهو فرق ڪرڻ ضروري آهي ته حياتياتي نقل ڇا آهي ۽ ٽيڪنيڪل نقل ڇا آهي.
حياتياتي نقل: ساڳئي تصديق جو تجربو مختلف مواد سان ڪيو ويو آهي (وقت، پودون، بيچ، ردعمل پليٽ).
حياتياتي نقل
اچو ته مثال طور مرچ جي جراثيم جي علاج کي وٺو.اسان ABC جي ٽن ٻوٽن تي جراثيم ڪش اسپري ڪرڻ چاهيون ٿا، پوءِ ABC جا ٽي ٻوٽا ٽي حياتياتي نقل آهن، ۽ اهي ساڳيا تصديق ٿيل تجربا آهن جيڪي مختلف مواد سان ڪيا ويا آهن.پر هڪ تجربي جي طور تي، هڪ ڪنٽرول جي ضرورت آهي، تنهنڪري اسان ٻوٽي A جي تجرباتي گروپ ٺاهڻ لاء ٻوٽي A جي شاخن مان هڪ کي اسپري ڪري سگهون ٿا، ۽ ڪنٽرول گروپ ٺاهڻ لاء ٻوٽي A جي ٻين شاخن کي اسپري نه ڪيو وڃي.ساڳيو ڪم B ۽ C لاءِ.
ٽيڪنيڪل نقل (ٽيڪنيڪل نقل): اهو هڪ بار بار تجربو آهي جيڪو آپريشن جي سببن جي غلطين کان بچڻ لاء ٺهيل آهي، جيڪو اصل ۾ ساڳيو مواد ۾ شامل هڪ نقلي سوراخ آهي.ٻئي علاج ۽ ڪنٽرولن کي ھدف جين ۽ اندروني حوالن جين جي نقل واري سيٽنگون (گھٽ ۾ گھٽ ٽي) ھجن.
ٽيڪنيڪل ورجائي
جراثيمن سان علاج ڪيل مرچ کي ٻيهر مثال طور وٺو.ٻوٽي A جي تجرباتي گروپ لاءِ، اسان ان جي ٽارگيٽ جين ۽ اندروني حوالن جين لاءِ ترتيب وار 1، 2 ۽ 3 جا ٽي پي سي آر سوراخ ڪيا، ته جيئن معلوم ٿيڻ کان پوءِ اوسط ورتو وڃي.ٻوٽن جي ڪنٽرول لاءِ A گروپ به ساڳيو ئي علاج ڪيو وڃي ٿو.ساڳي طرح B ۽ C ٻوٽن جو به ساڳيو علاج ڪريو.هي ٽيڪنيڪل ورجائي آهي.
اهو قابل ذڪر آهي تهانگن اکرن ۾ جيڪو داخل ٿئي ٿو اهو حياتياتي ورهاڱي آهي، ۽ ٽيڪنيڪل ورهاڱي اهو آهي ته ڇا تجرباتي عمل ۾ ڪي بي ترتيب واقعا موجود آهن، ته جيئن تجرباتي نتيجن کي معتبر بڻائي سگهجي، يعني انهن جي اوسط کي کڻڻ سان غلطين کان بچڻ لاء جيئن اسين اڪثر چوندا آهيون.
ناڪاري ڪنٽرول- NTC ۽ NRT
NTC (نان ٽيمپليٽ ڪنٽرول), هڪ ڪنٽرول بغير ٽيمپليٽ، استعمال ڪيو ويندو آهي تصديق ڪرڻ لاء ته ڇا تجرباتي مواد آلوده آهي.عام طور تي، پاڻي هڪ نموني طور استعمال ڪيو ويندو آهي.جيڪڏهن ڪو فلورسنٽ ردعمل آهي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته نيوڪلڪ ايسڊ آلودگي ليبارٽري ۾ ٿي چڪي آهي.
اهي آلودگي ڪٿان اينديون آهن: ناپاڪ پاڻي، اڻڄاتل ريجنٽ جن ۾ endogenous DNA، پرائمر آلودگي، ليبارٽري سامان آلودگي، ايروسول آلودگي، وغيره، استعمال ڪرڻ جي ضرورت آهي RNase scavengers ۽ RNase inhibitors.Aerosol آلودگي ڳولڻ تمام ڏکيو آهي.تصور ڪريو ته توهان جي ليبارٽري سموگ وانگر آهي، مختلف نيوڪليڪ ايسڊز هوا ۾ معطل آهن.
NRT (No-Reverse Transscriptase)، ريورس ٽرانسڪرپشن کان سواءِ ڪنٽرول، غير ريورس ٽرانسڪرپشن ٿيل آر اين اي کي منفي ڪنٽرول جي طور تي، جيڪو جي ڊي اين اي جي باقيات جو ڪنٽرول آهي.
جين ايڪسپريشن ڪرڻ وقت، ريورس ٽرانسڪرپشن کان پوءِ سي ڊي اين اي جي مقدار کي معلوم ڪندي آر اين اي جي مقدار معلوم ڪئي ويندي آهي.جيڪڏهن آر اين اي کي صاف ڪرڻ دوران gDNA باقي رهي ٿي، ته اهو تجرباتي نتيجن ۾ غلطي جو سبب بڻجندو، ڇاڪاڻ ته حاصل ڪيل اصل نتيجا gDNA ۽ cDNA آهن.مجموعي سطح تي، نه صرف سي ڊي اين، پر جي ڊي اين اي کي مڪمل طور تي ختم ڪرڻ جي ضرورت آهي آر اين اي ڪڍڻ دوران.
MIQE (2) - نموني ڄاڻ
نام نهاد نموني معلومات جو مطلب اهو آهي ته جڏهن اسان qPCR بابت هڪ مضمون شايع ڪريون ٿا، اسان کي نموني معلومات کي واضح طور تي بيان ڪرڻ گهرجي، جيڪو مضمون جو هڪ لازمي حصو آهي.اهڙي طرح، جڏهن اسان نموني کي پروسيس ڪريون ٿا، اسان کي پڻ پنهنجي عملن کي منظم ڪرڻ گهرجي نموني جي صحيحيت کي يقيني بڻائڻ لاء.
نموني جي وضاحت صرف هڪ نتيجو آهي، ۽ اسان کي وڌيڪ ڌيان ڏيڻ گهرجي مواد کي سڄي تجربي دوران ورتو ويو.
تجرباتي مواد جي چونڊ
رت جا نمونا - تازو رت چونڊيو، 4 ڪلاڪن کان وڌيڪ نه.سيل جا نمونا - زوردار واڌ جي عرصي ۾ تازو سيلز گڏ ڪرڻ لاءِ چونڊيو.جانورن جو ٽشو - تازو، زوردار وڌندڙ ٽشو چونڊيو.ٻوٽي جو ٽشو - تازو، نوجوان ٽشو چونڊيو.
توهان ضرور ڏٺو هوندو ته انهن چند جملن ۾ هڪ اهم لفظ آهي: fresh.
مٿين نموني لاءِ، مارڪيٽ تي بهترين، قيمتي ۽ مستحڪم کٽ Foregene جي کٽ آهي، جيڪا جلدي ۽ آساني سان انهن جي ڊي اين اي ۽ آر اين اي ڪڍي سگهي ٿي.
جانورن جي ڪل آر اين اي آئسوليشن کٽ
پلانٽ ٽوٽل آر اين اي آئسوليشن کٽ
پلانٽ ٽوٽل آر اين اي آئسوليشن ڪٽ پلس
تجرباتي مواد جو ذخيرو
عام طور تي ڳالهائڻ، اسان نموني کي ذخيرو ڪرڻ جي سفارش نه ڪندا آهيون، جيڪڏهن حالتون اجازت ڏين ٿيون.تنهن هوندي به، اهڙا ڪيترائي دوست آهن جيڪي نمونن وٺڻ کان فوري طور تي تجربا نه ٿا ڪري سگهن، ۽ ڪجهه کي ته نموني لاء فيلڊ ۾ مائع نائٽروجن ٽينڪ کڻڻ جي ضرورت آهي.
هن قسم جي محنتي دوست لاء، مان صرف اهو چئي سگهان ٿو ته توهان reagent consumables سمجهي نه ڪندا آھن.هاڻي ڪيتريون ئي ريجنٽ استعمال ڪندڙ ڪمپنيون ريجنٽ پيدا ڪن ٿيون جيڪي آر اين اي نموني کي ڪمري جي حرارت تي ذخيرو ڪري سگھن ٿيون، ۽ توهان انهن کي استعمال ڪرڻ لاء چونڊي سگهو ٿا.روايتي اسٽوريج جو طريقو مائع نائٽروجن اسٽوريج آهي، هڪ ننڍڙو مائع نائٽروجن ٽينڪ استعمال ڪندي جيڪو کڻڻ آسان آهي.نموني کي ليبارٽري ۾ واپس آڻڻ کان پوء، ان کي -80 ° C فرج ۾ ذخيرو ڪريو.
آر اين اي جي تجربن لاء، ڇهن لفظن جي اصول جي پيروي ڪرڻ گهرجي:گھٽ درجه حرارت، ڪو به اينزيما نه،۽تيز .
گھٽ درجه حرارت جو تصور سمجھڻ آسان آھي.بغير اينزيمز جي، RNase دنيا ۾ هر جڳهه آهي جنهن ۾ اسين رهون ٿا (ٻي صورت ۾ توهان کي ايڇ آئي وي جي ڪري ماريو وڃي ها)، تنهنڪري تجربو ڪرڻ وقت RNase کان ڪيئن بچجي اهو هڪ تمام اهم تصور آهي؛تيز،دنيا ۾ ڪو به ڪنگ فو ناهي جنهن کي ٽوڙي نه سگهجي، صرف رفتار کي ٽوڙي نٿو سگهجي.
تنهن ڪري، هڪ لحاظ کان، ڪڍڻ جو وقت جيترو ننڍو هوندو، اوترو بهتر کٽ.ڇو ٿواڳوڻوجي کٽ رفتار تي زور ڏئي ٿو، ڇاڪاڻ ته اهي چڱي طرح ڄاڻن ٿا.
پي ايس: ڪجهه ڇوڪريون تمام احتياط سان تجربا ڪنديون آهن، پر اهي ايتريون سٺيون نه هونديون آهن جيترو سالن جي محنت کان پوءِ.اهي محسوس ڪن ٿا ته خدا غير منصفانه آهي، ٻين جي باري ۾ شڪايت، ۽ زندگي ڳولي رهيا آهن.حقيقت ۾، هوء اهو نه سمجهي.هن آر اين اي جي چڱي طرح حفاظت نه ڪئي، ۽ سليم ڊنڪ پليئر نفيس هو.جڏهن هو تجربو ڪري رهيو هو ته هن سوچيو ته هو سلم ڊنڪ کي ٽي دفعا، پنج دفعا ۽ ٻه ڀاڱا ختم ڪندو، پر هن تجربو چڱيءَ طرح ڪيو.
نوٽ: سست، RNase حملي جا وڌيڪ موقعا.ڪيئن پنهنجو پاڻ کي تيز ڪرڻ لاء تربيت؟ڪو به طريقو ناهي، صرف وڌيڪ مشق.
مختلف تجربن ۽ مختلف نمونن لاء، اڃا به ضروري آهي ته وڌيڪ ادب پڙهڻ ۽ پروسيسنگ لاء هڪ مناسب طريقو چونڊيو.نموني گڏ ڪرڻ ۽ اسٽوريج جي عمل لاءِ، MIQE جي ضرورت آهي ته اهو ڪاغذ ۾ واضح طور تي لکيل هجي، ته جيئن نظرثاني ڪندڙ ڪاغذ جي اعتبار جو جائزو وٺي سگهن، ۽ اهو پڻ آسان آهي ته حيران ڪندڙ نوجوانن لاءِ توهان جو تجربو ٻيهر ورجايو وڃي.
جيتوڻيڪ حياتياتي تجربا مشڪل آهن، اهي اعليٰ آهن.جيڪڏهن توهان محتاط نه آهيو، توهان دنيا کي ختم ڪري سگهو ٿا.مثال طور، SARS کي بايو ڪيميڪل بحران ۾ آڻڻ، يا 1.3 بلين ماڻهن کي بچائڻ لاءِ هائبرڊ چانور ٺاهڻ.هيٺ ڏنل تصوير هڪ ڪيميائي تجربو آهي، توهان کي سمجهڻ گهرجي ته توهان کي پنهنجي تحقيق تي ڪيترو فخر آهي صرف هن جي ڊڪ جهڙي ظاهري کي ڏسي.ان کي وساريو، هن کي ڪارو نه ڪريو.
MIQE (3) - نيوڪليڪ ايسڊ ڪڍڻ.
نيوڪليڪ ايسڊ ڪڍڻ هڪ وڏو واقعو آهي، ۽ سڀ ماليڪيولر حياتيات جا تجربا نيوڪليڪ ايسڊ ڪڍڻ سان شروع ٿين ٿا.سڀ کان پهريان، اچو ته نقل ڪريون MIQE جي مواد کي نيوڪليڪ ايسڊ ڪڍڻ تي.
هن فارم کي ڏسي، توهان سطح تي نه رهي سگهو ٿا.فارم هڪ dogma آهي.هڪ اعلي شاگرد ٿيڻ لاء، توهان کي پڇڻ گهرجي ڇو.ھن جدول جو ضروري مواد آھي: تعاقبآر اين اي جي پاڪائي، سالميت، استحڪام، ۽ اخراج جي مقدار .
جو پهريون حصوعمل يا اوزار نيوڪليڪ ايسڊ ڪڍڻ وارو قدم آهي.جيڪڏهن توهان هڪ خودڪار نيوڪليڪ ايسڊ ڪڍڻ لاءِ استعمال ڪريو ٿا (ترقي يافته، خريد ڪرڻ لاءِ مهرباني ڪري مون سان رابطو ڪريو)، توهان کي اوزار جي ماڊل جو نالو ظاهر ڪرڻو پوندو.
کٽ جو نالو ۽
تبديليءَ جي تفصيل لاءِ ڪھڙي کٽ استعمال ڪئي وئي، ڪھڙا خاص ريجينٽ شامل ڪيا ويا يا ڪھڙا خاص عمل ڪيا ويا، واضح طور بيان ڪيو وڃي ته جيئن ٻيا آساني سان توھان جي تجربي کي ورجائي سگھن.
ڪجهه ماڻهو خاص نموني ڪڍڻ وقت ڪجهه خاص ريجنٽ شامل ڪندا آهن، اهو سوچيندا آهن ته هي انهن جو ڳجهو هٿيار آهي ۽ ٻين کي نه ٻڌايو.ان کي راز ۾ رکڻ دوران، اهي توهان جي مضمون کي چمڪائڻ جو موقعو پڻ وڃائي ڇڏيندا آهن.هوشيار نه ٿيو، توهان کي سائنسي تحقيق ۾ ملڪ جي پراڻي ژانگ کان وڌيڪ ايماندار ٿيڻو پوندو، جيڪڏهن توهان هوشيار ٿيڻ چاهيو ٿا، مضمون توهان کي بيوقوف بڻائي ڇڏيندو.
کٽ جو پراڊڪٽ نمبر ياد رکڻ گهرجيجڏهن توهان کٽ جو آرڊر ڏيو ۽ مضمون لکو.کٽ تي عام طور تي ٻه نمبر هوندا آهن: ٻلي-ڪيٽلاگ نمبر (پراڊڪٽ نمبر، آرٽيڪل نمبر)، لوٽ-پراڊڪٽ لاٽ نمبر (ظاهر ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو ته پراڊڪٽ ڪهڙي بيچ مان آيو آهي).
ان کان علاوه، CAS نمبر اڪثر استعمال ڪيو ويندو آهي جڏهن بايو ڪيميڪل ريگينٽس کي ترتيب ڏيو، ۽ مان ان کي گڏجي مقبول ڪندس.CAS نمبر اهو نمبر آهي جيڪو آمريڪي ڪيميائي سوسائٽي طرفان هر نئين ڪيميائي دوا کي ڏنو ويو آهي.عام طور تي، ٽي نمبر هڪ ڊش سان ڳنڍيل آهن.رشوئي جو CAS نمبر: 7732-18-5.ڪيميڪل اڪثر ڪري گھڻا نالا آھن، پر CAS نمبر منفرد آھي.جڏهن دوا آرڊر ڪندي، توهان پهريان ان جو CAS نمبر چيڪ ڪري سگهو ٿا.
گهر جي ويجهو، اسان کي اهي شيون واضح طور تي بيان ڪرڻ جي ضرورت آهي؟حقيقت ۾، اهو پڻ آر اين اي ڪڍڻ جي معيار کي جانچڻ آهي.اوزارن ۽ ڪِٽن جو استعمال آر اين اي ڪڍڻ کي وڌيڪ مسلسل بڻائيندو.عام ليبارٽريز جي extraction پيماني تي وڏي نه آهي، ۽ ان کي kits سان حاصل ڪري سگهجي ٿو.
DNase يا RNase علاج جا تفصيل
فلورسنٽ مقداري پي سي آر جو اهم مسئلو ڊي اين اي آلودگي کي روڪڻ آهي، ۽ جيڪڏهن آلودگي آهي ته تجربو نه ڪريو.تنهن ڪري، اهو ضروري آهي ته توهان ڊي اين اي کي پروسيس ڪرڻ لاء استعمال ڪيل عمل کي بيان ڪرڻ لاء، اهو ظاهر ڪرڻ لاء ته تجرباتي عمل ۾ ڊي اين اي مڪمل طور تي ۽ مڪمل طور تي هٽايو ويو آهي.هڪ اسڪيميٽ ڊراگرام جي نمائندگي ڪئي وئي آهي.
آر اين اي ۽ ڊي اين اي جو اسڪيميٽ ڊراگرام
عام طور تي، ڊي اين اي کي ختم ڪرڻ جو طريقو اهو آهي ته آر اين اي کي ڪڍڻ کان پوء ڊي نيس سان علاج ڪيو وڃي.بهرحال، اهي نسبتا پراڻي طريقا آهن.تجارتي آر اين اي ڪڍڻ واري ڪِٽ ڊي اين اي کي ڪڍڻ جي عمل دوران ڊي اين اي کي هٽائڻ جي قابل ٿي ويون آهن بغير ڊي اين ايز شامل ڪرڻ جي.مثال طور، Foregene مان ڪٽس جو هڪ سلسلو.
نوٽ: آر اين اي ڪڍڻ دوران ڊي اين اي کي هٽائڻ هڪ تمام خطرناڪ ٻلهاري تلوار آهي، جيڪا آر اين اي ڪڍڻ جي آپريشن جي وقت کي ڊگھي ڪندي ۽ آر اين اي جي تباهي جو خطرو وڌائيندو.بنيادي طور تي، اهو آر اين اي جي پيداوار ۽ پاڪائي جي وچ ۾ واپار آهي.
ان کان علاوه، سليڪا جي بنياد تي جذب ڪرڻ واري ڪالمن ۾ شامل ڪيل DNase جو مقدار تمام ننڍڙو آهي، ۽ اثر حاصل ڪرڻ لاء اعلي معيار جي DNase استعمال ٿيڻ گهرجي.Unoptimized DNase جلدي ۽ مڪمل طور تي هضم نه ٿي سگھي.اهو واپار جي ٽيڪنيڪل سطح جو امتحان آهي.يقينن، اڃا به وڌيڪ عجيب واپارين وارا آهن جيڪي فخر ڪن ٿا ته ڊي اين اي ڊي اين جي بغير ختم ڪري سگهجي ٿو.اهو چئي سگهجي ٿو ته جيڪو به اهو فخر ڪري ٿو ته ڊي اين اي مڪمل طور تي ڊي اين ايز کان سواء ختم ٿي سگهي ٿو اهو غدار آهي.ڊي اين اي نسبتاً مستحڪم ڊبل اسٽرينڊ ڍانچي آهي، ۽ ان کي صرف ڳالهائڻ ۽ کلڻ سان ختم نٿو ڪري سگهجي.
آلودگي جي تشخيص
تشخيص جو طريقو: اليڪٽرروفورسس جو پتو لڳائڻ، 1٪ agarose، 6V/cm، 15min، لوڊ ڪرڻ 1-3 ul
نيوڪليڪ اسيد مقداري تجزيو
عام طور تي هڪ UV spectrophotometer استعمال ڪندي ماپي ويندي آهي.اچو ته مون کي پھرين OD260، OD280، ۽ OD230 جي ٽن قدرن جي معنى کي مشهور ڪيو.
·OD260nm: اهو نيوڪليڪ ايسڊ جي سڀ کان وڌيڪ جذبي واري چوٽي جي جذب جي موج آهي، ۽ بهترين ماپيل قدر 0.1 کان 1.0 تائين آهي.جيڪڏهن نه، ان کي رينج اندر آڻڻ لاءِ نموني کي نرم ڪريو يا مرڪوز ڪريو.
·OD280nm: اهو پروٽين ۽ فينولڪ مادي جي سڀ کان وڌيڪ جذب ڪرڻ واري چوٽي جي جذب جي موج آهي.
·OD230nm: اهو ڪاربوهائيڊريٽ جي سڀ کان وڌيڪ جذب ڪرڻ واري چوٽي جي جذب جي موج آهي.
اڳيون، اچو ته هر اشاري جي ڪردار بابت ڳالهايون.A260 لاءِ، ان کي استعمال ڪري سگھجي ٿو نيوڪليڪ اسيد جي پيداوار کي ماپڻ لاءِ.جڏهن OD260=1، dsDNA=50μg/ml، ssDNA=37μg/ml، RNA=40μg/ml.
پاڪائي لاءِ، اسان کي انهن نسبتن کي ڏسڻ جي ضرورت آهي جيڪي اسان عام طور تي ڏسون ٿا: OD260/280 ۽ OD260/230.
خالص ڊي اين اي: OD260/280 لڳ ڀڳ 1.8 جي برابر آهي.جڏهن اهو 1.9 کان وڌيڪ آهي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته اتي آر اين اي آلودگي آهي، ۽ جڏهن اهو 1.6 کان گهٽ آهي، اهو اشارو ڪري ٿو ته اتي پروٽين ۽ فينول آلودگي آهي.
· خالص آر اين اي: 1.7
·OD260/230: چاهي اهو DNA هجي يا RNA، ريفرنس ويليو 2.5 آهي.جڏهن اهو 2.0 کان گهٽ آهي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته کنڊ، لوڻ ۽ نامياتي مادو جي آلودگي آهي.
آر اين اي سالميت
آر اين اي جي سالميت کي ماپڻ تمام ضروري آهي.عام طور تي، اهو ضروري آهي ته آر اين اي ڊينيچريشن جيل تجربو ڪيو وڃي ته ڇا 28S ۽ 18S RNA جي وچ ۾ روشني ٻه ڀيرا تعلق رکي ٿي.جڏهن ٽيون بينڊ 5S ظاهر ٿئي ٿو، ان جو مطلب اهو آهي ته آر اين اي خراب ٿيڻ شروع ڪيو آهي، سواء invertebrates جي.
آر اين اي معيار جي تشخيص لاءِ ڊيٽا: مٿين تجربن کان علاوه، آر اين اي سالميت جي لحاظ کان ڪجهه وڌيڪ جديد اوزار جا امتحان پڻ آهن، جهڙوڪ Experion خودڪار اليڪٽرروفورسس سسٽم جو RQI سالميت ٽيسٽ، جيڪو اهو معلوم ڪري سگهي ٿو ته ڇا RNA پوشيده طور تي خراب ٿي وئي آهي.
سائنسي تحقيق ۾، فلورسنٽ مقداري پي سي آر ٽارگيٽ جين ۽ اندروني حوالن جين جي وچ ۾ هڪ مقابلو آهي.تنهن ڪري، آر اين اي نموني جي حفاظت، آر اين اي ڪڍڻ، وغيره جي عمل ۾، بنيادي مقصد آر اين اي جي سالميت کي يقيني بڻائڻ آهي.
ڪيئن RNA جي سالميت ٽارگيٽ جين ۽ اندروني حوالن جين جي وچ ۾ توازن کي متاثر ڪري ٿي، هيٺ ڏنل شڪل مان آساني سان سمجهي سگهجي ٿو.تباهي جين جي نامڪمليءَ جو سبب بڻجندي، چاهي اها اندروني حوالي جي جين جي اڻپوري هجي يا ٽارگيٽ جين جي نامڪمليت، ان جو ڊيٽا تي وڏو اثر پوندو.
ٽارگيٽ جين ۽ ريفرنس جين جو اسڪيمي ڊاگرام، صحيح نه هجڻ گهرجي
ممنوع ٽيسٽ (ڇا CT قدر کي دٻايو ويو آهي اعلي يا گهٽ ڪنسنٽريشن يا ٻين حالتن ۾)
هن انگن اکرن کي مثال طور وٺندي، پنجن وکرن جي Ct قدر هن ريت آهن.وڪڙن جي وچ ۾ CT قدرن جي ورڇ اڻ برابري آھي، ۽ سي ٽي قدرن کي اعلي ۽ گھٽ ڪنسنٽريشن جي ھيٺان دير ٿي وڃي ٿي، جيڪا پي سي آر جي روڪٿام جي صورت آھي.
اهم نقطو: آر اين اي ڪڍڻ جي عمل ۾، اسان کي غلط فهمين کي ختم ڪرڻ ۽ صحيح خيالن کي قائم ڪرڻ جي ضرورت آهي.
غلط خيال آهي: آر اين اي ڪڍڻ صرف پيداوار جو تعاقب ڪري ٿو، اهو سوچڻ ته آر اين اي جو وڏو مقدار حاصل ڪيو ويندو، بهتر.حقيقت ۾، جڏهن اسان مقدار جو اندازو لڳايو، جيڪڏهن جين جو تعداد تمام وڏو ناهي، اسان کي وڌيڪ آر اين اي جي ضرورت ناهي.آر اين اي جو مقدار جيڪو توهان ڪڍو ٿا ڪافي کان وڌيڪ آهي.
صحيح تصور آهي:آر اين اي ڪڍڻ کي پاڪيزگي، سالميت ۽ استحڪام جي پيروي ڪرڻ گهرجي.صفائي کي يقيني بڻائي سگهجي ٿو ته ايندڙ ريورس ٽرانسپشن کي روڪيو نه ويو آهي ۽ ڊيٽا ڊي اين اي پاران متاثر نه ٿيندي.سالميت ٽارگيٽ جي تسلسل ۽ اندروني حوالن جي توازن کي يقيني بڻائي ٿي.استحڪام مستحڪم نموني لوڊ ڪرڻ کي يقيني بڻائي ٿي.
MIQE (4) - ريورس ٽرانسپشن
غلط فهمي: اعلي نموني جي مقدار جو تعاقب.
صحيح تصور: تسلسل (استحکام) جو تعاقب ڪريو، قطع نظر آر اين اي لوڊ ٿيل مقدار جي، ريورس ٽرانسپشن جي ڪارڪردگي مسلسل رهي ٿي، انهي ڳالهه کي يقيني بڻائي ته cDNA ۾ فرق حقيقت ۾ mRNA ۾ فرق کي ظاهر ڪري سگھن ٿا.
اسان هن عمل جي وضاحت ڪريون ٿا هڪ اسڪيمي ڊراگرام سان:
ريورس ٽرانسپشن ڪارڪردگي جو اسڪيمياتي ڊراگرام، صحيح نه ٿيو
سڀ کان پهريان، اسان کي ريورس ٽرانسپشن جي عمل ۽ پي سي آر جي عمل جي وچ ۾ فرق سمجهڻ جي ضرورت آهي.پي سي آر ڪيترن ئي حرارتي ۽ اينيلنگ جي عملن مان گذري ٿو، ۽ ٽارگيٽ جو ٽڪرو تيزيء سان وڌي ٿو؛جڏهن ته ريورس ٽرانسڪرپشن ۾ اهو عمل نه هوندو آهي، اسان تصور ڪري سگهون ٿا ته ريورس ٽرانسڪرپشن اصل ۾ هڪ کان هڪ آهي نقل جي عمل دوران، آر اين اي جا ڪيترائي ٽڪرا
جيئن ته سي ڊي اين اي معلومات جا ڪيترائي ٽڪرا حاصل ڪري سگهجن ٿا، ان کي هينئر تائين سمجهڻ گهرجي، ڇاڪاڻ ته ننڍا ۽ وڏا ٽڪرا ريورس ٽرانسڪرائب ڪيا ويا آهن، ۽ اهو ناممڪن آهي ته هڪ ٽڪرا تي ڌيان ڏيڻ.۽ ڇاڪاڻ ته آر اين اي جو مقدار نسبتاً ننڍو آهي، ان ڪري حاصل ڪيل سي ڊي اين اي جو مقدار به نسبتاً ننڍو آهي، پي سي آر جي برعڪس، جنهن جو هڪ وسيع اثر آهي، تنهن ڪري ان جو پتو لڳائڻ بنيادي طور تي ناممڪن آهي.
سي ڊي اين اي الیکٹروفورسس جا نتيجا
ٻيو، مثالي طور، ريورس ٽرانسڪرپشن هڪ کان هڪ ڪيو ويندو آهي، پر ڪنهن به ڪمپني کان ڪو به ريورس ٽرانسڪرپٽ اهو اثر حاصل ڪري سگهي ٿو.بنيادي طور تي، سڀ کان وڌيڪ ريورس ٽرانسپيسس جي ڪارڪردگي 30-50٪ جي وچ ۾ ويندڙ آهي.جيڪڏهن اهو معاملو آهي، ته اسان وٽ نسبتا مستحڪم ريورس ٽرانسپشن ڪارڪردگي هوندي، جيڪا اسان هن شڪل ۾ ڏسڻ چاهيون ٿا: 3 RNAs 2 cDNAs حاصل ڪن ٿا، 6 RNAs 4 cDNAs حاصل ڪن ٿا، تنهنڪري ڪيترو به نمونو لوڊ ڪيو وڃي، ريورس ٽرانسپشن ڪارڪردگي نسبتا مستحڪم آهي.اسان ان صورتحال کي ڏسڻ نٿا چاهيون جتي ريورس ٽرانسپشن ڪارڪردگي غير مستحڪم آهي ۽ اعلي حراست کي روڪيو ويو آهي.
تنهن ڪري، ڪيئن تصديق ڪجي ته ڇا ريورس ٽرانسپشن ڪارڪردگي مستحڪم آهي؟طريقو بلڪل سادو آهي، توهان کي صرف هڪ مقابلي جي ٽيسٽ ڪرڻي آهي: هڪ اهو آهي ته آر اين اي کي ٻيڻو ڪرڻ کان پوءِ سي ڊي اين اي ۾ ٽرانسڪرپشن کي ٻيڻو ڪرڻ ۽ ٻيو اهو آهي ته سي ڊي اين اي ۾ ريورس ٽرانسڪرائب ڪرڻ کان پوءِ ٻيڻو ڊيليوشن ڪيو وڃي ۽ پوءِ qPCR ڪيو وڃي ته حاصل ڪيل سلوپ کي ڏسڻ لاءِ اهو مطابقت آهي.هڪ اعليٰ شاگرد جي حيثيت ۾، توهان کي ان کي سيڪنڊن ۾ سمجهڻ گهرجي.جيئن هيٺ ڏيکاريل آهي:
آر اين اي ۽ سي ڊي اين اي جي گھٽتائي کي جانچڻ لاءِ ته ڇا ريورس ٽرانسپشن جي ڪارڪردگي مستحڪم آهي
ريورس ٽرانسڪرپٽ ۽ کٽ
ڪيئن مڪمل fluorescent quantitative PCR شاندار reverse transscriptase ۽ کٽ آهي.Reverse transcriptase تقريبن ٻن قسمن ۾ ورهايل آهي ذريعن مطابق، AMV ياايم-ايم ايل وي، ۽ انهن جي ڪارڪردگي ساڳي آهي جيڪا ٽيبل ۾ ڏيکاريل آهي.
RNase H سرگرمي
RNase H آهي Ribonuclease H، چيني نالو ribonuclease H آهي، جيڪو هڪ Endoribonuclease آهي جيڪو خاص طور تي DNA-RNA هائبرڊ زنجير ۾ RNA کي هائيڊولائيز ڪري سگهي ٿو.RNase H phosphodiester بانڊز کي hydrolyze نه ٿو ڪري سگهي سنگل اسٽرينڊ يا ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي يا آر اين اي ۾، يعني اهو سنگل اسٽرينڊ يا ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي يا آر اين اي کي هضم نٿو ڪري سگهي.عام طور تي سي ڊي اين اي جي سيڪنڊ اسٽينڊ جي ترڪيب ۾ استعمال ٿيندو آهي.
عجيب ڳالهه آهي.اسان چئون ٿا ته ريورس ٽرانسڪرپٽ ۾ RNase H سرگرمي آهي، نه ته ريورس ٽرانسڪرپٽ ۾ RNase H شامل آهي، ۽ اهو ٿي سگهي ٿو ته RNase H کي ريورس ٽرانسڪرپٽ کان الڳ ڪرڻ ممڪن نه هجي، شايد ان ڪري جو ريورس ٽرانسڪرپٽ ۾ ڪجهه گروپن جي ٺهڻ جي ڪري اها سرگرمي ريورس ٽرانسڪرپٽيز جي ڪري ٿي.
تنهن ڪري، AMV جي اعلي ريورس ٽرانسپشن ڪارڪردگي کان سواء، ان جي RNase H سرگرمي سي ڊي اين جي پيداوار کي گھٽائي ٿي.يقينن، ريگينٽ ٺاهيندڙ مسلسل پنهنجون شيون بهتر ڪري رهيا آهن RNase H سرگرمي کي ختم ڪرڻ لاءِ ريورس ٽرانسڪرپٽ ۾ جيترو ممڪن ٿي سگهي سي ڊي اين اي جي پيداوار کي وڌائڻ لاءِ.
annealing گرمي پد
مختلف درجه حرارت تي آر اين اي جي ثانوي ساخت
مختلف درجه حرارت تي RNA جي ثانوي ڍانچي لاءِ مٿي ڏنل شڪل ڏسو، ۽ مخصوص درجه حرارت ۽ لوڻ جي ڪنسنٽريشن جي حالتن هيٺ ٽارگيٽ فريگمينٽ جي ثانوي ساخت کي طئي ڪرڻ لاءِ mFold آن لائن ٽول استعمال ڪريو.55°C تي، RNA جو ثانوي ڍانچو اڃا به تمام پيچيده آهي، ريورس ٽرانسڪرپٽ ڪم نٿو ڪري سگهي، ۽ ثانوي ڍانچي مڪمل طور تي 65°C تائين حل نه ٿي ڪري سگھجي، جڏهن ته AMV ۽ M-MLV جو وڌ ۾ وڌ درجه حرارت هن درجه حرارت کان تمام گهٽ آهي.
ڇا ڪجيثانوي ڍانچي خود ٽيمپليٽ جو مڪمل جوڙو آهي، جيڪو پرائمر ۽ ريورس ٽرانسڪرپٽ ۽ ٽيمپليٽ جي وچ ۾ مضبوط مقابلي جو سبب بڻجي ٿو، جنهن جي نتيجي ۾ مسئلن جو هڪ سلسلو آهي جهڙوڪ گهٽ E ۽ خراب ريپٽيبلٽي.
ڇا ڪجيصرف ممڪن حد تائين اينيلنگ جي درجه حرارت کي وڌايو.
ڪيترائي ريجنٽ ٺاهيندڙن جينياتي انجنيئرنگ ذريعي انهن جي ريورس ٽرانسپيسس کي بهتر بڻائي رهيا آهن.ڪجهه رد عمل جي درجه حرارت کي وڌائي ٿو، جهڙوڪ جفان ۽ آئيڊيلائي، ۽ ڪجهه RNase H اينزيم جي فعال گروپ کي هٽائي ٿو ته اينزيم ۽ آر اين اي ٽيمپليٽ جي وچ ۾ لاڳاپا کي بهتر بڻائي.هاء لاڳاپو مقابلي سان ثانوي جوڙجڪ کي نچوض ڪري سگهي ٿو ۽ آسانيء سان پڙهي سگهي ٿو، ۽ پڻ تمام گهڻو بهتر ڪري ٿو ريورس ٽرانسپشن جي ڪارڪردگي کي.
اهم نقطو: ريورس ٽرانسڪرپشن وڌيڪ ضروري آهي ته ريورس ٽرانسڪرپشن جي ڪارڪردگيءَ جي تسلسل کي جاري رکڻ لاءِ (اينزائمز نه رڳو ڪارآمد هجڻ گهرجن پر مستحڪم پڻ)، بجاءِ لوڊ ٿيل نموني جي مقدار جي، جيڪڏهن اهو خاص طور تي وڏي پيماني تي فلورسنٽ مقداري PCR نه آهي، اهو هرگز ممڪن نه ٿيندو.گهڻن سي ڊي اينز.
مختلف ٺاهيندڙن پڻ تسلسل جي تعاقب ۾ ڪجهه ڪوششون ڪيون آهن.مثال طور، اڪثر ڪمپنيون هاڻي ريورس ٽرانسڪرپشن کي وڪرو ڪرڻ لاء معياري کٽ جي طور تي پيڪ ڪيو آهي، جيڪو سٺو انتخاب آهي.
مثال طور، Foregene's RT Easy Series kits:
RT Easy I (ماسٽر پريمڪس فرسٽ اسٽرينڊ سي ڊي اين اي سنٿيسس ڪٽ لاءِ)
MIQE (5) - ٽارگيٽ جين ڄاڻ
مٿي ڏنل شڪل بيان ڪري ٿي
1. ڇا هي جين بار بار تجربن لاءِ اثرائتو آهي، عام طور تي بار بار تجربن ذريعي تصديق ڪري سگهجي ٿي.
2. جيني ID، توهان کي خبر آهي.
3. جين جي ڊيگهه، ٽارگيٽ جين جي ڪل ڊيگهه يقيني طور تي ڪو مسئلو ناهي.پرائمر ڊزائين ڪرڻ وقت، پڪ ڪريو ته ايمپليڪن جي ڊيگهه 80-200bp جي وچ ۾ آهي ته بهتر ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي کي يقيني بڻائي سگهجي.
4. ترتيب ڌماڪي جي مقابلي جي معلومات، ٽارگيٽ جين کي جين بينڪ ۾ مقابلو ڪرڻ جي ضرورت آهي ته غير مخصوص واڌ کي روڪڻ لاء.
5. pseudogenes جي موجودگي.هڪ pseudogene هڪ عام جين وانگر هڪ ڊي اين اي ترتيب آهي پر ان جي عام ڪم کي وڃائي ٿو.اهو اڪثر eukaryotes جي multi-gene خاندان ۾ موجود آهي.اهو عام طور تي ψ جي نمائندگي ڪري ٿو.اهو جينوم ۾ هڪ غير فنڪشنل جينومڪ ڊي اين اي ڪاپي آهي جيڪو ڪوڊنگ جين جي ترتيب سان تمام گهڻو ملندو آهي.، عام طور تي نقل ٿيل نه آهن، ۽ نه ئي واضح جسماني معني آهي.
6. پرائمر جي پوزيشن Exons ۽ introns جي نسبت.شروعاتي سالن ۾، جڏهن اسان ڊي اين اي آلودگي جي مسئلي کي حل ڪيو، اسان اڪثر ڪري پرائمر، ايڪسونز ۽ انٽرن جي پوزيشن تي ڌيان ڏنو، ۽ عام طور تي ڊي اين اي ايمپليفڪيشن کان بچڻ لاءِ پرائمر کي اندروني طور تي ڊزائين ڪرڻ تي غور ڪيو.مھرباني ڪري ھيٺ ڏنل شڪل ڏسو: ڪارو اندرين جي نمائندگي ڪري ٿو، مختلف بلوز Exons جي نمائندگي ڪري ٿو، گلابي عام پرائمر جي نمائندگي ڪري ٿو، ۽ روشن ڳاڙھو intron-spanning primers جي نمائندگي ڪري ٿو.
اسڪيميٽ، ڪڏهن به سچو
اهو ڪهڙو هڪ مڪمل منصوبو لڳي ٿو، پر حقيقت ۾، اڪثر ڪيسن ۾، ٽرانس-انٽرون پرائمر ايترو جادوگر نه هوندا آهن جيترو تصور ڪيو ويو آهي، ۽ اهي پڻ غير مخصوص وڌائڻ جو سبب بڻجندا.تنهن ڪري ڊي اين اي آلودگي کي روڪڻ جو بهترين طريقو ڊي اين اي کي مڪمل طور تي هٽائڻ آهي.
7. ٺاھڻ جي اڳڪٿي.ھن مثال کي ٻيهر استعمال ڪندي، mFold آن لائن ٽول استعمال ڪريو ھدف جي ٽڪري جي ثانوي ڍانچي کي مخصوص درجه حرارت ۽ لوڻ جي ڪنسنٽريشن تي طئي ڪرڻ لاءِ.
مختلف درجه حرارت تي آر اين اي جي ثانوي ساخت
ثانوي ڍانچي خود ٽيمپليٽ جو مڪمل ڪندڙ جوڙو آهي، جيڪو پرائمر ۽ ٽيمپليٽ جوڙڻ جي وچ ۾ مضبوط مقابلي جو سبب بڻجندو، ۽ پرائمر بائنڊنگ جا موقعا گهٽ هوندا آهن، جنهن جي نتيجي ۾ مسئلن جو هڪ سلسلو هوندو آهي جيئن گهٽ E ۽ خراب ريپٽيبلٽي.سافٽ ويئر جي اڳڪٿي جي ذريعي، جيڪڏهن ڪو ثانوي ڍانچي جو مسئلو ناهي، ته اهو وڏو هوندو.جيڪڏهن اتي آهي، اسان جي پيروي ڪيل آرٽيڪل خاص طور تي بحث ڪندو ته هن مسئلي کي ڪيئن حل ڪجي.
MIQE (6) - qPCR Oligonucleotides
فلورسنٽ مقداري پي سي آر لاءِ، پهرين شيءِ جنهن سان توهان هر روز جدوجهد ڪندا آهيو آر اين اي ڪڍڻ آهي، ۽ ٻي شيءِ ٿي سگهي ٿي پرائمر ڊيزائن.
سڀ کان پهريان، اسان اڃا تائين MIQE چيڪ لسٽ جي مطابق پرائمر ڊيزائن بابت قاعدن جي جانچ ڪندا آهيون.اهو ايترو سادو آهي ته ڌاڙيلن کي کلڻ کپي، ۽ اسان ان کي هڪ جملي ۾ ختم ڪري سگهون ٿا: پرائمر پروب جي ترتيب ۽ پوزيشن ۽ ترميم جو طريقو معلوم ڪريو.پرائمر صاف ڪرڻ واري طريقي جي لاءِ، پرائمر سنٿيسس في الحال تمام سستو آهي، qPCR PAGE ۽ مٿي صاف ڪرڻ جي طريقن جي لائق آهي، ۽ سنٿيسس اوزار جي معلومات اهم ناهي.ڪيترائي ماڻهو ڏهاڪن تائين پرائمر ڪري رهيا آهن ۽ نه ڄاڻندا آهن ته سنٿيسائزر ABI3900 آهي.
پرائمر ڊيزائن جي اصولن جي حوالي سان، توهان کي انهن کي روٽ ذريعي ياد ڪرڻ جي ضرورت ناهي، ڇاڪاڻ ته اڪثر پرائمر ڊيزائن سافٽ ويئر يا آن لائن اوزار انهن مسئلن جو خيال رکندا آهن (سفارش ڪيل آن لائن اوزار primer3.ut.ee/)، ۽ 99.999٪ پرائمر ڊيزائن دستي طور تي نه ڪيو ويو آهي، ڏسجي ته ليکڪ ڪڏهن ڪڏهن هڪ ڏينهن ۾ سوين پرائمر ٺاهيندو آهي، جيڪڏهن توهان هڪ هڪ ڪري پڙهو ته اهو ٿي ويندو.
پرائمر ڊزائين ڪرڻ کان پوءِ صرف ھيٺين پوائنٽن کي چيڪ ڪريو:
1. ڊزائين پرائمر 3′ آخر جي ويجهو: cDNA فرسٽ اسٽرينڊ سنٿيسس لاءِ oligo dT پرائمر استعمال ڪرڻ جي صورت ۾، ريورس ٽرانسڪرپشن جي ڪارڪردگي ۽ RNA سالميت کي نظر ۾ رکندي، ڊزائين ڪيل پرائمر کي 3′ آخر جي ويجهو ڊزائين ڪرڻ جي ضرورت آهي ته جيئن ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي کي بهتر بڻائي سگهجي.هيٺ ڏنل وضاحت ڪرڻ لاءِ تصوير استعمال ڪريو (انهي کي سمجهڻ جو ڪو طريقو ناهي):
ڇو ته پرائمر کي 3 جي آخر جي ويجهو ٺاهيو وڃي، اهو صحيح نه هجڻ گهرجي
2. TM ويليو: Tm ويليو 55-65°C تي آهي (ڇاڪاڻ ته exonuclease سرگرمي سڀ کان وڌيڪ 60°C تي آهي) ۽ GC مواد 40%-60% تي آهي.
3. BLAST: جينوم جي غير مخصوص وڌائڻ کان بچڻ لاءِ، BLAST کي اضافي تصديق لاءِ استعمال ڪيو وڃي.
MIQE (7) - qPCR عمل
1. qPCR کٽ
MIQE جي گهرجن جي مطابق، اسان کي مضمون ۾ مڪمل رد عمل جي حالتن کي واضح طور تي بيان ڪرڻ گهرجي، جنهن ۾ PCR ردعمل سسٽم جي ترتيب، ڪهڙي ڪٽ استعمال ڪئي وئي آهي، ٺاهيندڙ ڪير آهي، ردعمل سسٽم ڪيترو وڏو آهي، ڇا رنگ جو طريقو يا تحقيق جو طريقو استعمال ڪيو ويو آهي، پي سي آر پروگرام سيٽنگون.ويٽرن ڊرائيورن کي يقيني طور تي معلوم ٿيندو ته جيستائين کٽ کي چونڊيو وڃي، مٿين ڄاڻ بنيادي طور تي طئي ڪيو وڃي.
في الحال، فلورسنٽ مقدار جي پي سي آر کٽ جي پيداوار ۽ پيداوار هڪ تمام پختو ٽيڪنالاجي آهي.جيستائين توهان انتهائي خراب ٺاهيندڙن کي نه چونڊيو، مسئلن جو امڪان وڌيڪ نه آهي، پر اسان اڃا تائين توهان سان ڪجهه پوائنٽون حصيداري ڪرڻ چاهيون ٿا:
گرم شروع ٿيندڙ Taq اينزيم:PCR جو سڀ کان اهم حصو گرم-شروع Taq اينزيم آهي.مارڪيٽ تي گرم شروع ٿيندڙ اينزائمز عام طور تي ٻن قسمن ۾ ورهايل آهن، هڪ ڪيميائي طور تي تبديل ٿيل گرم-اسٽارٽ اينزائم آهي (توهان ان کي پيرافين ايمبيڊنگ جي طور تي تصور ڪري سگهو ٿا)، ۽ ٻيو آهي اينٽي باڊي جي ترميم لاءِ هڪ گرم شروع ٿيندڙ اينزائم (اينٽيجن اينٽي باڊي بائنڊنگ).ڪيميائي ترميمي گرم شروع ٿيندڙ اينزيميمس جو هڪ ابتدائي طريقو آهي.جڏهن هڪ خاص درجه حرارت تي پهچي ويندو آهي، اينزيم پنهنجي سرگرمي کي جاري ڪندو.اينٽي باڊي-تبديل ٿيل گرم-اسٽارٽ اينزائم اينزيم جي سرگرمي کي بلاڪ ڪرڻ لاءِ حياتياتي طريقا استعمال ڪندو آهي.جڏهن هڪ خاص درجه حرارت تي پهچي ويندو آهي، اينٽي باڊي کي رد ڪيو ويندو ۽ پروٽين جي طور تي غير فعال ڪيو ويندو، ۽ اينزيم سرگرمي کي راند ۾ آندو ويندو.
تنهن هوندي به، هن جو استعمال ڇا آهي؟اهو معاملو آهي، اينٽي باڊي-تبديل ٿيل اينزائمز جي ڇڏڻ واري سرگرمي ڪيميائي طور تي تبديل ٿيل اينزائمز جي ڀيٽ ۾ تيز آهي، تنهنڪري حساسيت جي لحاظ کان، اينٽي باڊي-تبديل ٿيل اينزائيمز کي ٿورو فائدو آهي، انهي ڪري ته مارڪيٽ ۾ ڪٽس ۾ بنيادي طور تي ڪي ڪيميائي طور تي تبديل ٿيل اينزائمز نه آهن.جيڪڏهن اتي آهي، ته پوء هن ڪاريگر جي ٽيڪنالاجي اڃا تائين هزارين سالن جي دور ۾ ڦاسي پيا آهن.
ميگنيشيم آئن ڪنسنٽريشن:پي سي آر جي رد عمل ۾ ميگنيشيم آئن ڪنسنٽريشن تمام ضروري آهي.مناسب ميگنيشيم آئن ڪنسنٽريشن Taq اينزيم جي سرگرمي کي جاري ڪري سگھي ٿو.جيڪڏهن ڪنسنٽريشن تمام گهٽ آهي، اينزيم جي سرگرمي کي خاص طور تي گهٽجي ويندي.جيڪڏهن ڪنسنٽريشن تمام گهڻو آهي، اينزيم-ڪيٽيلائزڊ غير مخصوص امپليفڪيشن کي وڌايو ويندو.ميگنيشيم آئنز جي ڪنسنٽريشن پرائمر جي انيلنگ، ٽيمپليٽ جي پگھلڻ واري گرمي پد ۽ پي سي آر پروڊڪٽس تي به اثر انداز ٿينديون، ان ڪري وڌايل ٽڪرن جي پيداوار کي متاثر ڪندي.ميگنيشيم آئن جي ڪنسنٽريشن کي عام طور تي 25 ايم ايم تي ڪنٽرول ڪيو ويندو آهي.يقينا، هڪ سٺي کٽ لاء، ميگنيشيم آئن جي ڪنسنٽريشن کي چڱي طرح ڪنٽرول ڪيو وڃي.ڪجهه واپارين ريگينٽ ۾ ميگنيشيم آئن چيليٽنگ ايجنٽ شامل ڪندا آهن، جيڪي ميگنيشيم آئن ڪنسنٽريشن جي خودڪار ترتيب جي اثر کي حاصل ڪري سگھن ٿا.
فلورسنٽ رنگ جي ڪنسنٽريشن:فلورسنٽ ڊائي، جيڪو SYBR گرين آهي جيڪو اسان عام طور تي استعمال ڪندا آهيون، خاص طور تي ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي جي ننڍڙي نالي سان بائنڊنگ ڪندي فلورسنس پيدا ڪري ٿو، ڇاڪاڻ ته ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي سان ڊائي جو پابند ٿيڻ غير مخصوص آهي، يعني جيستائين ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي آهي، تيستائين ان کي ڊي اين اي سان ملايو وڃي ٿو، پوءِ ان کي پرائمر-ڊبل- اسٽرينڊ ڊي اين اي سان ملائي سگهجي ٿو. سسٽم ان سان گڏ هڪ پس منظر سگنل ٺاهيندو.
PS: ان جي روشنيءَ سان حساس خاصيتن جي ڪري، مارڪيٽ تي پروڊڪٽس عام طور تي ناسي مبهم سينٽرفيوج ٽيوب ۾ پيڪيج ٿيل آهن (جيئن هيٺ ڏنل تصوير ۾ ڏيکاريل آهي).تنهن هوندي به، هن هڪ مسئلي کي منهن ڏيندو.اهو ڏسڻ ڏکيو آهي ته ڇا مائع کي چوسيو ويو آهي جڏهن نموني نموني.هن سلسلي ۾، Qingke واقعي سڀ کان وڌيڪ استعمال ڪندڙ-دوست آهي (جيئن هيٺ ڏنل تصوير ۾ ڏيکاريل آهي)، ۽ شفاف ٽيوب هڪ مبهم ٽين بيگ ۾ ڀريل آهي.پوءِ ان کي ٽين جي ٿانءَ ۾ وجھو، روشنيءَ کان بچڻ جي سھولت کي نظر ۾ رکندي ۽ نمونو وٺڻ.توهان کي صحيح پراڊڪٽ نمبر چونڊڻ گهرجي.TSE204 هڪ سپر قيمتي-مؤثر وجود آهي، جيڪو مون کي گھاس پوکڻ چاهيندو آهي.
فلورسنٽ رنگ جي ڪنسنٽريشن پڻ تمام ضروري آهي.جيڪڏهن ڪنسنٽريشن تمام گهٽ آهي، ته ايمپليفڪيشن وکر پوئين مرحلي ۾ مٿي نه ويندو ۽ مڪمل نه هوندو؛جيڪڏهن ڪنسنٽريشن تمام گهڻي آهي، اهو شور جي مداخلت جو سبب بڻجندو.جيئن ته فلورسنٽ مقداري PCR بنيادي طور تي CT جي قيمت تي منحصر آهي، جيڪڏهن فلورسنٽ رنگ جي ڪنسنٽريشن کي صحيح طرح سان ترتيب نه ڏني وئي آهي، گهٽ پوائنٽ اعلي نقطي کان بهتر آهي.يقينن، مناسب رنگ جي ڪنسنٽريشن بهترين آهي.
ROX: ROX رنگ استعمال ڪيا ويندا آھن چڱيءَ طرح سان فلورسنس سگنلن جي غلطين کي درست ڪرڻ لاءِ.ڪجهه اوزار ٺاهيندڙن کي حساب ڪتاب جي ضرورت هوندي آهي، جڏهن ته ٻيا نٿا ڪن.مثال طور، Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR amplification instrument جي استعمال لاءِ عام طور تي calibration جي ضرورت پوندي آهي، جنهن ۾ 7300، 7500، 7500Fast، StepOnePlus وغيره شامل آهن. عام کٽ جون هدايتون ان کي بيان ڪنديون.
Foregene جي qPCR Mix ۾ ROX رنگ پڻ شامل آهي، جيڪو مختلف ماڊلز ۾ استعمال لاءِ آسان آهي.
ڪمزور هائيڊروجن بانڊ علاج: ڪمزور هائيڊروجن بانڊ جو علاج هڪ نسبتا ٽيڪنيڪل معاملو آهي.ڪجھ به نه پڙهيو آهي ڪيترن ئي ڪتن جا دستور، پر انهن مان ڪنهن به هن موضوع جو ذڪر نه ڪيو آهي.حقيقت ۾، اهو تمام ضروري آهي.بنيادن جو ميلاپ خاص طور تي هائڊروجن بانڊ جي طاقت تي منحصر آهي.مضبوط هائيڊروجن بانڊ عام امپليڪشن آهن، ۽ ڪمزور هائيڊروجن بانڊ غير مخصوص ايمپليفڪيشن جو سبب بڻجن ٿا.جيڪڏهن ڪمزور هائيڊروجن بانڊز کي چڱيءَ طرح ختم نٿو ڪري سگهجي، غير مخصوص امپلائيشن کان بچي نٿو سگهجي.ليکڪ جي دائري اندر، صرف چند ڪمپنين هن مسئلي کي محسوس ڪيو آهي.جڏهن توهان کٽ خريد ڪندا آهيو، توهان حوالو ڪري سگهو ٿا ته ڇا توهان ان سلسلي ۾ هڪ حل تي غور ڪيو آهي انهي کٽ لاءِ جيڪو توهان چونڊڻ چاهيو ٿا.
رد عمل جي مقدار: 20-50ul سسٽم وڌيڪ عام طور تي استعمال ڪيو ويندو آهي، ۽ ننڍن حجمن جي غلطين جو امڪان آهي.عام طور تي ڳالهائڻ، کٽ هدايتون پي سي آر جي رد عمل جي مقدار جي استعمال جي سفارش ڪندي.هوشيار نه ٿيو ۽ خرچ بچائڻ لاءِ ننڍا حجم استعمال ڪريو.جو مقصد.واپارين پاران تجويز ڪيل مقدار اصل ۾ آزمائي ڪئي وئي آهي، ۽ ٿي سگهي ٿو ته اهي غلطين جو مسئلو حل نه ڪري سگھن ٿيون جيڪي ننڍن حجمن جي ڪري.
2. ٽيوب پليٽ جو ٺاهيندڙ ۽ آرٽيڪل نمبر
هرڪو ڄاڻي ٿو فلورسنٽ مقدار جي PCR جو اصول.فلورسنس گڏ ڪرڻ خاص طور تي پي سي آر ٽيوب ڪيپس ذريعي ڪيو ويندو آهي.جڏهن پي سي آر استعمال ٿيندڙ سامان کي چونڊيو، ٻن نقطن تي ڌيان ڏيو: سٺي روشني ٽرانسميشن ۽ اوزار لاء مناسب.عام طور تي ڳالهائڻ، مين اسٽريم برانڊز جا بورڊ ۽ ٽيوب ٺيڪ آهن، پر توهان کي موافقت جي لحاظ کان احتياط سان چونڊڻو پوندو، ٻي صورت ۾ توهان اوزار استعمال ڪرڻ جي قابل نه هوندا.
4. مٿين سطح جي ڄاڻ
MIQE (8) - qPCR جي تصديق
هي آهي qPCR جي اولين ترجيح!ڪيترا هيرو هتي سانت ۾ پئجي ويا آهن.يقينا، اهو پڻ ممڪن آهي ته توهان خوش قسمت آهيو ۽ جن جين جو توهان اڀياس ڪيو آهي سادو آهي، تنهنڪري توهان برفاني غار ذريعي واء سان گڏ گذريو.qPCR جي تصديق واري معلومات جو مقصد ڊيٽا جي اعتبار کي جانچڻ آهي.اسان ھيٺ ڏنل ضروري تصديق جي معلومات لسٽ ڪريون ٿا:
1.Specificity ٽيسٽ
ٽارگيٽ جين ايمپليفڪيشن جي خاصيت کي جانچيو وڃي ٿو ته ڇا اليڪٽرروفورسس تصوير هڪ واحد بينڊ آهي؛تسلسل جي تصديق؛پگھلڻ وارو وکر ڏسڻ لاءِ ته ڇا چوٽي جو نقشو اڪيلو آهي.enzyme هضم جي تصديق ۽ ٻيا طريقا.
هتي، اسان ٽي تي ڌيان ڏين ٿاهُو پگھلڻ واري وکر جي طريقي کي استعمال ڪندي غير مخصوص ايمپليفڪيشن جو تجزيو.عام طور تي، جڏهن اسان پرائمر ٺاهيندا آهيون، پراڊڪٽ جي ٽڪڙي جي سائيز 80-200bp جي رينج ۾ هجڻ ضروري آهي، جيڪا PCR پراڊڪٽ جي پگھلڻ واري درجه حرارت کي 80-85 ° C جي حد تائين پهچائي ٿي.تنهن ڪري، جيڪڏهن متفرق چوٽيون آهن، اتي ٻيون غير مخصوص ايمپليفڪيشن پراڊڪٽس هجڻ گهرجن.جيڪڏهن چوٽي 80 ° C کان هيٺ ظاهر ٿئي ٿي، ان کي عام طور تي پرائمر ڊيمر سمجهيو ويندو آهي.جيڪڏهن چوٽي 85 ° C کان مٿي ظاهر ٿئي ٿي، ان کي عام طور تي سمجھيو ويندو آهي DNA آلودگي يا وڏن ٽڪرن جي وڌيڪ غير مخصوص واڌارو.
نوٽ: ڪڏهن ڪڏهن 80 ° C تي صرف هڪ چوٽي آهي.هن وقت، هن تصور تي عمل ڪرڻ ضروري آهي.اهو امڪان آهي ته amplification نتيجا سڀ پرائمر dimers آهن.
عام پگھلڻ وارو وکر (اڪيلو چوٽي بغير ڪنهن غير مخصوص واڌ جي)
مشڪلاتي پگھلڻ وارو وکر (غير مخصوص چوٽي جي غير مخصوص واڌ)
【ڪيس جو تجزيو】
اتي هڪ مکيه چوٽي آهي، پر پرائمر ڊيمر سنجيده آهي
هيٺ ڏنل شڪل ۾ سنگل چوٽي پگھلڻ وارو وکر آساني سان توهان جي اکين کي ٺڳي سگهي ٿو، اهو سوچڻ ته اهو هڪ بهترين تجربو آهي، پر نتيجو مڪمل طور تي غلط آهي.هن وقت، اسان کي پگھلڻ جي درجه حرارت کي ڏسڻو پوندو.چوٽي جو گرمي پد 80 ° C کان هيٺ آهي، جيڪو مڪمل طور تي پرائمر-ڊيمر آهي.
ڪوبه نشانو ٽڪرو، سڀ پرائمر ڊائمر
هتي، منهنجو ڀاء روڪي نٿو سگهي.هيٺ ڏنل تصوير هڪ موبائيل فون سان ورتي وئي آهي جيڪا مون ڏانهن موڪليل هڪ بدمعاش طرفان موڪلي وئي آهي.هن استعمال ڪيل ريجنٽ سڀ عام طور تي صنعت ۾ استعمال ٿيل برانڈز آهن.هو هڪ ٽي-پريفڪس برانڊ کان ٻئي ٽي-پريفڪس برانڊ ۾ تبديل ٿيو.مان سمجهان ٿو ته توهان اڳ ۾ ئي اندازو لڳايو آهي.بدمعاش مون ڏانهن رڙ ڪئي: ”پهرين تصوير ۾ استعمال ٿيل ريجينٽ تمام سٺو آهي، ۽ چوٽي اڪيلو آهي.بعد ۾، توهان جي تجويز ڪيل ريجنٽ استعمال ڪرڻ کان پوء، اها ٻي تصوير وانگر، مخلوط چوٽي سان.تو مون کي بيزار ڪري ڇڏيو آهي."
ٻن گرافن کي الڳ ڪريو.پهرين نظر ۾، هڪڙي کي هڪ چوٽي آهي، ۽ ٻئي کي ٻيڻو چوٽي آهي.بيوقوف، هڪ واحد چوٽي يقينا ٺيڪ آهي.ڇا اهو سچ آهي؟
Dou E کان وڌيڪ خراب، جيڪڏهن آئون هيٺ ڏنل تصوير ۾ ٻه تصويرون رکان، توهان کي فوري طور تي سمجهي ويندي.حقيقت ۾، اسان هن قسم جي تصوير سان آساني سان مفلوج آهيون.محتاط تجزيي کان پوء، اسان کي معلوم ٿئي ٿو ته: پهرين انگن اکرن جي چوٽي 75 ° C تي آهي، جيڪا مڪمل طور تي پرائمر ڊيمر آهي؛ٻئي نمبر جي چوٽي 75 ° C ۽ 82 ° C تي ظاهر ٿئي ٿي، گهٽ ۾ گهٽ اتي موجود آهن پيداوار ظاهر ٿئي ٿي.
شاگردن کان موٽ جون تصويرون
تنهن ڪري بنيادي مسئلو ريگينٽس جو مسئلو ناهي، پر پرائمر ڊيزائن جو مسئلو.ساڳئي وقت، اهو پڻ ثابت ٿئي ٿو ته ڪجهه وڏيون برانڊون لوهه جي معيار جا نه آهن، ۽ اهو پڻ ثابت ٿئي ٿو ته منهنجي ڀاء اڳ چيو: اهو ريگينٽ برانڊ ناهي جيڪو توهان جي آرٽيڪل کي سپورٽ ڪري ٿو.اهو توهان جو آرٽيڪل آهي جيڪو ريگينٽس جي برانڊ کي وڌايو.ذرا تصور ڪريو، جيڪڏهن اسڪمبگ ريگينٽس کي تبديل نه ڪيو، غلط ڊيٽا جرنل ڏانهن موڪلي ويندي، ۽ ڇا ٿيندو اهو هڪ سانحو هوندو.
2. خالي ڪنٽرول جي Ct قدر
وضاحت نه ڪريو، جيڪڏهن خالي ڪنٽرول ۾ Ct قدر آهي، ڇا اهو آلودگي ناهي؟تنهن هوندي، توهان کي اڃا تائين سمجهڻ جي ضرورت آهي ته ڪهڙي خالي ڪنٽرول کي Ct قدر آهي.جيڪڏهن اهو NTC آهي، ان جو مطلب اهو آهي ته غير ملڪي ڊي اين اي آهي جهڙوڪ ريجنٽ آلودگي.جيڪڏهن اهو NRT آهي، ان جو مطلب آهي ته ڪڍيل آر اين اي ۾ ڊي اين اي آلودگي آهي.
3. معياري وکر
سلپ ۽ ڳڻپيوڪر فارمولا سميت، پي سي آر ڪارڪردگي فارمولا ذريعي حساب ڪري سگهجي ٿو.هڪ مڪمل تجربو 3.32 تائين پهچڻ لاءِ معياري وکر جي سلپ جي ضرورت آهي، ۽ 0.9999 تائين پهچڻ لاءِ R².
4. لڪير متحرڪ رينج
رد عمل جي متحرڪ حد لڪير آهي.معياري وکر پيدا ڪرڻ لاءِ استعمال ٿيل ٽيمپليٽ مطابق، متحرڪ رينج ۾ گھٽ ۾ گھٽ 5 ڪنسنٽريشن گريڊينٽ شامل ھجن، ۽ اعلي ڪنسنٽريشن گريڊينٽ ۽ گھٽ ڪنسنٽريشن گريڊينٽ تي Ct قدرن جي تبديلي تي ڌيان ڏيو.
5. چڪاس جي درستگي
qPCR جي نتيجن ۾ تبديليون، يعني خراب ريپٽيبلٽي، يعني ناقص درستگي، ڪيترن ئي عنصرن جي ڪري ٿين ٿيون، جن ۾ درجه حرارت، ڪنسنٽريشن ۽ آپريشن شامل آهن.qPCR جي درستگي عام طور تي گھٽ ڪنٽرول ٿي ويندي آھي جيئن نقل نمبر گھٽجي وڃي.مثالي طور تي تجرباتي تغير جي اندر، هي ٽيڪنيڪل تغير حياتياتي تغير کان الڳ هجڻ گهرجي، ۽ حياتياتي نقلون سڌو سنئون گروپن يا علاجن جي وچ ۾ qPCR نتيجن ۾ شمارياتي فرق کي حل ڪري سگهن ٿيون.خاص طور تي تشخيصي اسيسز لاءِ، سائيٽن ۽ آپريٽرن جي وچ ۾ بھترين بين الاقوامي پرائيزيشن (دوباري قابليت) جي رپورٽ ٿيڻ گھرجي.
6. پتو لڳائڻ جي ڪارڪردگي ۽ LOD (ملٽي پلڪس qPCR ۾)
LOD 95٪ مثبت نموني جي سڀ کان گھٽ ڪنسنٽريشن آھي.ٻين لفظن ۾، ھدف جين نقلن جي ھڪڙي سيٽ جي اندر موجود LOD جو تسلسل ناڪام رد عمل جي 5٪ کان وڌيڪ نه ٿيڻ گھرجي.جڏهن ملٽي پلڪس qPCR تجزيا ڪري رهيا آهن، خاص طور تي هڪ ئي وقت ۾ پوائنٽ ميوٽيشنز يا پوليمورفيزم جي سڃاڻپ لاءِ، ملٽي پلڪس qPCR کي اهو ثبوت مهيا ڪرڻ جي ضرورت آهي ته هڪ ئي ٽيوب ۾ ڪيترن ئي ٽارگيٽ ٽڪڙن جي درستگي سان سمجهوتو نه ڪيو ويو آهي، هڪ ئي ٽيوب جي چڪاس ۽ سنگل ٽيوب جي چڪاس جي ڪارڪردگي ۽ LOD ساڳيو هجڻ گهرجي.خاص طور تي جڏهن اعلي ڪنسنٽريشن ٽارگيٽ جينس ۽ گهٽ ڪنسنٽريشن ٽارگيٽ جينس هڪ ئي وقت وڌائي رهيا آهن، هن مسئلي تي ڌيان ڏيڻ گهرجي.
مسئلا ۽ حلعام طور تي ڳالهائڻ، مسئلا اڪثر ڪري qPCR ڊيبگنگ ۾ هيٺ ڏنل پهلوئن تي ڌيان ڏئي ٿو:
· غير مخصوص واڌارو
· پرائمر ڪنسنٽريشن جو مشڪل انتخاب ۽ پرائمر-ڊائمرز سان مشڪلات
· annealing گرمي پد غلط آهي
· ثانوي ڍانچي امپليفڪيشن جي ڪارڪردگي کي متاثر ڪري ٿو
غير مخصوص واڌارو
غير مخصوص واڌاروعام طور تي غور ڪيو ويندو آهي ته ڇا پرائمر ڊزائين مناسب ناهي، پر جيڪڏهن توهان پرائمر کي تبديل ڪرڻ ۾ جلدي نه آهيو، توهان هيٺ ڏنل طريقا آزمائي سگهو ٿا پهرين (اصول پڻ ڳنڍيل آهي):
· اينيلنگ جي درجه حرارت کي وڌايو - ڪمزور هائيڊروجن بانڊ کي برقرار رکڻ جي قابل نه بڻائڻ جي ڪوشش ڪريو؛
· مختصر اينيلنگ ۽ ڊگھو وقت - ڪمزور هائڊروجن بانڊن جو موقعو گھٽايو؛
· پرائمر ڪنسنٽريشن کي گھٽايو - بيڪار پرائمر ۽ غير ھدف وارن علائقن جي پابند ٿيڻ جو موقعو گھٽايو؛
گھٽ وڌائڻ جي ڪارڪردگي
غير مخصوص ايمپليفڪيشن جي برعڪس صورتحال - گھٽ ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي، ۽ گھٽ ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي کي منهن ڏيڻ لاءِ قدم صرف ان جي ابتڙ آهن:
· اينيلنگ ۽ ڊگھائي وقت کي وڌايو؛
· ٽي-قدم پي سي آر ۾ تبديل ڪريو ۽ اينيلنگ جي درجه حرارت کي گھٽايو؛
· پرائمر ڪنسنٽريشن وڌايو؛
Ps: ڪيترائي گريجوئيٽ شاگرد جيڪي 90 جي ڏهاڪي ۾ پيدا ٿيا آهن، اهي پڙهائڻ نٿا چاهين ته تجربن کي ڊيبگ ڪيئن ڪجي، ۽ اميد آهي ته کٽ مڪمل طور تي اهو مسئلو حل ڪري سگهي ٿي (جيڪڏهن توهان گريجوئيشن کان پوءِ ريسرچ ۽ ڊولپمينٽ ڪرڻ لاءِ ري ايجنٽ ڪمپني ۾ وڃڻ چاهيو ٿا)، حقيقت ۾ ريجنٽ ٺاهيندڙ به اهو ئي سوچيندا آهن، مون کي اميد آهي ته اهو هڪ بيوقوفي آهي جڏهن توهان حاصل ڪري سگهو ٿا، انڪري ٺاهيندڙن جي تمام گهڻي ڪوشش آهي ته ان کي حل ڪرڻ لاءِ غير معمولي ڪوششون شامل آهن. ڪمزور ايڇ-بانڊ جذب عوامل جو تعارف.مسئلي کي آساني سان حل ڪرڻ لاءِ، بيوقوفن کي اڃا تائين ريگينٽ ڪمپني جو تعارف پڙهڻو پوندو ته ڇا ڪو اهڙو عنصر آهي جيڪو ڪمزور هائيڊروجن بانڊ جذب ڪري ٿو.
پرائمر ڪنسنٽريشن جو مشڪل انتخاب ۽ پرائمر-ڊائمرز سان مشڪلات
طريقو 1: عام طور تي ڳالهائڻ، qPCR لاءِ ڪٽ جون هدايتون تجويز ڪيل سسٽم ۽ تجويز ڪيل پرائمر ڪنسنٽريشن.
طريقو 2: پرائمر ڪنسنٽريشن گريجوئيٽ ترتيب ڏيندي ڊيبگنگ.هيٺ ڏنل تصوير هڪ ڪمپني کان چوري ڪئي وئي آهي واضع ڪرڻ لاء.هيٺ ڏنل انگ اکر ڏيکاري ٿو فلورسنس مقداري نتيجن کي ٽن پرائمر ڪنسنٽريشن گريڊينٽس (100nM، 250nM، 500nM) ۽ چار ٽيمپليٽ ڪنسنٽريشن گريڊينٽس (0.1ng، 1ng، 10ng، 100ng).تجرباتي نتيجن جي Ct قدر ھيٺ ڏنل آھي:
پرائمر ڪنسنٽريشن سليڪشن ھر پرائمر ڪنسنٽريشن کي ھيٺئين لڪير ۾ ڳنڍيو:
پرائمر ڪنسنٽريشن جو انتخاب واضح آهي، 100nM ۽ 250nM جي پرائمر ڪنسنٽريشن جو لڪير وارو لاڳاپو بهتر آهي، ۽ 500nM جي پرائمر ڪنسنٽريشن جو لڪير وارو تعلق نسبتاً خراب آهي.100nM ۽ 250nM ۾، 250nM جو Ct قدر نسبتا ننڍڙو آهي، تنهنڪري بهترين پرائمر ڪنسنٽريشن 250nM آهي.عام طور تي سخت پرائمر-ڊيمر پگھلڻ واري وکر ۾ ڏسي سگھجي ٿو.ڇا جيڪڏهن ڊزائين ڪيل پرائمر پرائمر-ڊيمر کان پاسو نٿا ڪري سگهن؟
طريقو 3: پرائمر جي مقدار کي گھٽايو ۽ اينيلنگ جي درجه حرارت کي وڌايو (وضاحت ڪرڻ جي ضرورت ناهي).
annealing گرمي پد جي تجرباتي قدر 60 ° C آهي.جيڪڏهن توهان پڪ ناهي ته، وڌيڪ مناسب اينيلنگ گرمي کي ڪيئن چونڊيو؟جواب ساڳيو آهي پرائمر ڪنسنٽريشن جي چونڊ-گريجوئيٽ ٽيسٽ.مسئلو بيان ڪرڻ لاءِ Bio-rad ڪمپني مان هڪ تصوير وٺو.ھڪڙي خاص ھدف واري ٽڪري کي وڌائڻ لاء، اٺ گرمي پد جي درجه بندي مقرر ڪريو، ھر ھڪڙي ٽن ورجائي سان، ۽ حاصل ڪيل ايمپليفڪيشن وکر ھيٺ ڏنل آھي:
annealing گرمي پد چونڊ:
· 70 ° C، 69 ° C - بنيادي طور تي، پرائمر کي گڏ نه ٿو ڪري سگهجي، تنهنڪري ڪو به واڌارو ناهي.
· 67.3°C - شروعات ۾ ٿورڙي مقدار ۾ واڌارو آهي، ۽ Ct قدر نسبتاً وڏو آهي.
· 64.5°C——Ct جو قدر گھٽجي ٿو.
· 60.7°C، 58.0°C، 56.2°C، ۽ 55.0°C تي، Ct قدرون بنيادي طور تي مستحڪم هونديون هيون، پر آخري فلوروسينس قدر مختلف هئا.
ڪيئن چونڊيو؟اصول: پهريون اصول اعليٰ Ct قدر آهي.ساڳئي Ct قدر لاءِ، ڊيمرائيزيشن ۽ غير مخصوص ايمپليفڪيشن کان بچڻ لاءِ اعليٰ اينيلنگ درجه حرارت چونڊيو.جيتوڻيڪ اتي 55 ° C تي هڪ اعلي فلوروسنس قدر آهي، ان ۾ ڊيمرز يا غير مخصوص ايمپليفڪيشن ٿي سگهي ٿي.
پر جيڪڏهن توهان جيترو هوشيار آهيو، توهان ضرور سوچيندا: منطقي طور تي، جيڪڏهن PCR ردعمل تمام مخصوص آهي، جيستائين پرائمر ڪنسنٽريشن گهٽ ۾ گهٽ ضرورت کان وڌيڪ آهي، بلند ۽ گهٽ پوائنٽس جو ڪو به اثر نه هجڻ گهرجي، جهڙوڪ فلورسنٽ رنگ ۽ ڊي اين ٽي پي.درحقيقت، جيستائين annealing گرمي پد صحيح طور تي بهتر ڪيو ويو آهي، Ct قدر تي پرائمر ڪنسنٽريشن جو اثر قدرتي طور تي گھٽجي ويندو.
اينيلنگ جي درجه حرارت کي صحيح طور تي بهتر ڪيو ويو آهي، ۽ CT تي پرائمر ڪنسنٽريشن جو اثر گھٽجي ويندو
ثانوي ڍانچي تي اثر انداز ٿئي ٿو amplification ڪارڪردگي
اچو ته ان مسئلي کي بيان ڪرڻ لاءِ Bio-rad مان تصوير ڪڍون.اهو هڪ ثانوي ڍانچي سان جين کي وڌائڻ لاءِ گرمي پد جي درجه بندي پڻ ٺاهي ٿو.
ثانوي جوڙجڪ پيدا ٿئي ٿي
اهو ڏسي سگھجي ٿو ته جيئن درجه حرارت جو درجو گهٽجي ٿو، پروڊڪٽس ظاهر ٿيڻ شروع ٿي وڃن ٿيون ۽ Ct قدر اڳتي وڌي ٿو، 60.7 ° C تي گهٽ ۾ گهٽ قيمت تي پهچي ٿو، ۽ پوءِ جيئن درجه حرارت جو درجو گهٽجي ٿو، تيئن Ct قدر وڏي ٿيندي ويندي آهي.ان جي ابتڙ، جيئن درجه حرارت وڌي ٿو، ثانوي ڍانچي کلي ٿو ۽ وڌائڻ جي ڪارڪردگي وڌائي ٿي.هڪ خاص درجه حرارت تي پهچڻ کان پوء، گرمي پد ۾ اضافو وڌائڻ واري ڪارڪردگي کي بهتر نٿو ڪري سگهي.ڇاڪاڻ ته پرائمر هن وقت مستحڪم طور تي گڏ نه ٿا ڪري سگهن.تنهن ڪري،سڀ کان گھٽ Ct قدر سان درجه حرارت کي ڏسو، جيڪو ثانوي ساخت جي ٽيمپليٽ کي وڌائڻ لاءِ بهترين درجه حرارت آهي!يقينا، هوشيار بيوقوف ڄاڻڻ گهرجي ته جيڪڏهن اهو ضروري ناهي، اهو بهترين آهي پرائمر کي تبديل ڪرڻ ۽ ثانوي ساخت واري علائقي کان بچڻ لاء.
5. ايپليڪيشن جي سطح
MIQE - ڊيٽا جو تجزيو
ڊيٽا جو تجزيو خاص طور تي فلورسنٽ مقداري پي سي آر اوزار طرفان ڏنو ويو آهي.پوئين مضمون ۾، ڊيٽا جي تجزيي جو تمام گهڻو ڪم ڪيو ويو آهي، جهڙوڪ خالي ڪنٽرول، جنهن جي وضاحت ڪئي وئي آهي تجربن جي ڊيزائن ۾.اندروني حوالن جين، ورجائي انگ، وغيره کي واضح ڪيو ويو آهي.، هتي اسان بنيادي طور تي qPCR جي درخواست جي وضاحت ڪريون ٿا.
qPCR وڏي پيماني تي استعمال ڪيو ويندو آهي، ۽ تجرباتي تصديق ۽ نيوڪليڪ ايسڊ جي تشخيص سڀ کان عام طور تي استعمال ٿيل منظرنامو آهن.
مطلق quantification
لاگ (ابتدائي ڪنسنٽريشن) جو هڪ لڪير تعلق آهي سائيڪلن جي تعداد سان.ھڪڙي معياري وکر ھڪڙي معياري مان ٺاھي سگھجي ٿو ھڪڙي ڄاڻايل ابتدائي ڪاپي نمبر سان، اھو آھي، ايمپليفڪيشن ردعمل جو لڪير تعلق حاصل ڪري سگھجي ٿو.نموني جي Ct قدر جي مطابق، نموني ۾ ڪنسنٽريشن حساب ڪري سگهجي ٿو.ٽيمپليٽ جو مقدار شامل ڪرڻ لاء.
مطلق مقدار جي حساب ڪتاب جو طريقو
مڪمل مقدار کي معياري وکر تي ٻڌل هجڻ گهرجي.معياري وکر ٺاهڻ لاء، هڪ معيار جي ضرورت آهي.عام طور تي، معيار هڪ پلازميڊ آهي جيڪو ٽارگيٽ جين کي ڪلون ڪندي حاصل ڪيو ويو آهي.اهو پلاسميڊ ڇو آهي؟ڇاڪاڻ ته گول پلازميڊ ڊي اين اي سڀ کان وڌيڪ مستحڪم آهي.معياري پراڊڪٽ کي 5 کان 6 گريڊيئينٽ ۾ ڊبل ڪرڻ جي تناسب (10-گنا ڊيليوشن) جي مطابق گھٽايو، ۽ گھٽائڻ وقت يونيفارميت تي ڌيان ڏيو.اچو ته Ct قدر 15-30 جي وچ ۾ گر.
معياري تياري
ساڳي ئي وقت، ٽيسٽ ڪرڻ لاءِ نمونو به ان مطابق ٺهيو وڃي (ڊائليوشن فيڪٽر کي ياد رکو)، ۽ Ct قدر پڻ 15-30 جي وچ ۾ ٿيڻ گهرجي.معياري پراڊڪٽ + آزمائشي ٿيڻ جو نمونو گڏ مشين تي رکيل آهن.ڊوڙڻ کان پوء، معياري وکر کي معياري مواد سان ٺاهيو ويو، ۽ نموني کي جانچڻ لاء معياري وکر ۾ آندو ويو ته ڪنسنٽريشن کي ڳڻڻ لاء.
هيپاٽائيٽس بي وائرس HBV quantification هڪ عام مطلق مقدار آهي، جيڪو رت جي 1ml ۾ وائرس جي ڪاپي نمبر کي ڳڻڻ جي قابل آهي.
نقل نمبر جو حساب
نموني ڪنسنٽريشن کي جانچيو وڃي (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × dilution factor
نمونو ماليڪيولر وزن = بنيادن جو تعداد × 324
نمونن جو نقل نمبر جيڪو جانچيو وڃي ٿو (نقل/ul) = نموني جي ڪنسنٽريشن کي جانچيو وڃي ٿو / نموني جو ماليڪيول وزن × 6 × 1014
ڪاپي نمبر جي حساب ڪتاب جو طريقو
مقدار کي طئي ڪرڻ لاء مٿي ڏنل حساب ڪتاب جو طريقو آهي.هي هڪ رياضياتي مسئلو آهي جيڪو جونيئر هاءِ اسڪول مان گريجوئيشن ڪرڻ کان پوءِ حل ڪري سگهجي ٿو، ۽ رياضياتي مسئلا عام طور تي ڪمپيوٽرن ذريعي حل ڪيا ويندا آهن.جيڪڏھن توھان نٿا سمجھو، توھان اچي سگھوٿا ڳالھائڻ لاءِ.
نسبتي مقدار
تعلقي مقدار جو استعمال خاص طور تي سائنسي تحقيق ۾ ڪيو ويندو آهي.رت جي 1ml ۾ ڪيترا وائرس آهن، ۽ اهو هڪ ڊي اين اي وائرس آهي، اهو هڪ نسبتا طئي ڪرڻ وارو واقعو آهي: رت جي مقدار جو اندازو لڳائي سگهجي ٿو، ۽ ڊي اين اي وائرس نسبتا مستحڪم آهي.بهرحال، اسان لاءِ پتي ۾ ڪنهن خاص جين جي نقل ڪيل نقلن جي تعداد جو مقابلو ڪرڻ ڏکيو آهي، ڇاڪاڻ ته پتي جي سائيز، وزن ۽ نرمي جو اندازو لڳائڻ ڏکيو آهي، ڪڍيل آر اين اي جي مقدار جو اندازو لڳائڻ ڏکيو آهي، ۽ ريورس ٽرانسپشن جي ڪارڪردگي جو اندازو لڳائڻ پڻ ڏکيو آهي، اهو چوڻ آهي ته، ڪو به قدم اهو ڪري سگهي ٿو ته تجرباتي ڊيٽا استعمال نه ٿي سگهي.
تنهن ڪري، نسبتي مقدار کي لازمي طور تي هڪ عنصر متعارف ڪرائڻ گهرجي:اندروني حوالو جين.
ٻين لفظن ۾، لاڳاپو مقدار اصل ۾ ٽارگيٽ جين ۽ اندروني حوالن جين جي وچ ۾ مقابلو آهي.ساڳي ٽشو ۽ ساڳي سيل جي مقابلي ۾، نموني سائيز جو اثر، آر اين اي ڪڍڻ جي رقم، ريورس ٽرانسپشن ڪارڪردگي، ۽ پي سي آر ڪارڪردگي نسبتا ننڍڙو آهي.ننڍي نموني سائيز جي ڪري، ٻنهي اندروني حوالن جين ۽ ٽارگيٽ جينس نسبتا گھٽجي ويا.اهو ئي سبب آهي ته اسان اڳي ئي هڪجهڙائي ۽ استحڪام تي زور ڏنو آهي.
اندروني حوالي جين عام طور تي آهنگھر جي سنڀال جين(گھر ۾ رکڻ وارا جين)، جيڪي جينز جي ھڪڙي طبقي ڏانھن اشارو ڪن ٿا جيڪي سڀني سيلن ۾ مستحڪم طور تي بيان ڪيا ويا آھن، ۽ انھن جون شيون ضروري آھن جيڪي سيلز جي بنيادي زندگي جي سرگرمين کي برقرار رکڻ لاء.
هن تصور کي غلط نه ڪريو.هائوس ڪيپنگ جينز حياتياتي ڪم جا اصطلاح آهن، جڏهن ته اندروني حوالا جينز تجرباتي ٽيڪنيڪل اصطلاح آهن.گھر جي سنڀاليندڙ جين کي تصديق ڪرڻ جي ضرورت آھي ان کان اڳ جو انھن کي اندروني حوالن جين طور چونڊيو وڃي.
مثال طور، اسان ھيٺ ڏنل شڪل ۾ ڪيترائي گھر سنڀاليندڙ جين کي منتخب ڪيو انھن جي اظهار جي سطح کي جانچڻ لاءِ مختلف ٽشو سيلن ۾، ۽ ڏٺائون ته β-2-مائڪروگلوبلين جي اظهار جي سطح ٻين ٽن جين کان بلڪل مختلف ھئي، تنھنڪري انھن کي اندروني حوالن جين طور استعمال نٿو ڪري سگھجي.
اندروني ريفرنس جين جي اصلاح جي ڪم کي سمجھڻ کان پوء، اندروني حوالن جين جي تعارف جي ڪري ٻه الگورتھم نڪتل آھن.
· ٻٽي معياري وکر جو طريقو
·2 – △△Ct طريقو (CT قدر جي مقابلي جو طريقو)
جيڪڏھن توھان دلچسپي وٺندا آھيو نسلن ۽ جين جي ڪمن جي مطالعي ۾، مھرباني ڪري الگورٿم تي تحقيق کي ڇڏي ڏيو ۽ سڌو سنئون فارمول استعمال ڪريو، يا سڌو سنئون مشينون استعمال ڪريو؛جيڪڏهن توهان رياضي ۽ انجنيئرنگ ۾ سڌو ماڻهو آهيو، مهرباني ڪري آزاد ٿيو.
ڊبل معياري وکر جو طريقو
ڪنٽرول نموني جي ٽارگيٽ جين ۽ هائوس ڪيپنگ جين جو اندازو لڳايو ۽ نموني کي معياري وکر ذريعي جانچيو وڃي، ۽ پوء حساب ڪتاب جي فارمولا جي مطابق لاڳاپو قدر جو اندازو لڳايو، جيڪو لاڳاپو اظهار جي سطح آهي.
فائدا: سادو تجزيو، نسبتا سادو تجرباتي اصلاح
نقصان: هر جين لاء، تجربن جي هر دور کي معياري وکر ٺاهڻ گهرجي
ايپليڪيشن: جين ايڪسپريس ريگيوليشن جي مطالعي ۾ ٻن عام طور تي استعمال ٿيل ۽ سڃاتل نسبتا مقدار جي طريقن مان هڪ
فارمولا هن ريت آهي:
مثال هن ريت آهن:
مقدار جي نتيجي جي بنياد تي لاڳاپو رقم جي حساب ڪريو
2 – △△Ct طريقو (CT قدر جي مقابلي جو طريقو)
فائدا: معياري وکر ٺاهڻ جي ڪا ضرورت ناهي
نقصانات: اهو فرض ڪيو ويو آهي ته amplification ڪارڪردگي 100٪ جي ويجهو آهي؛معياري انحراف <5٪ آهي، ۽ معياري وکر ۽ ڪارڪردگي جي وچ ۾ هر امپليفڪيشن کي هڪجهڙائي سمجهيو وڃي ٿو؛تجرباتي حالتن جي اصلاح وڌيڪ پيچيده آهي.
ايپليڪيشن: جين ايڪسپريس ريگيوليشن جي مطالعي ۾ ٻن عام طور تي استعمال ٿيل ۽ سڃاتل نسبتا مقدار جي طريقن مان هڪ
يقينن، ايمپليفڪيشن جي ڪارڪردگي عام طور تي مڪمل طور تي ناممڪن آهي 1. اصلاح جو طريقو: جيڪڏهن اسان ڄاڻون ٿا ته ٽارگيٽ جين ۽ ريفرنس جين ۾ هڪجهڙائي جي ڪارڪردگي آهي، پر ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي 1 جي برابر ناهي، پوء 2－△△Ct کي درست ڪري سگهجي ٿو: (1+ Efficiency⼍t, amplification for 1+E) 0.95 آهي، پوءِ حساب ڪتاب جي فارمولا کي درست ڪري سگھجي ٿو 1.95－△△Ct
هينئر تائين، فلورسنٽ مقداري پي سي آر بابت مواد ختم ٿي چڪو آهي.
پوسٽ جو وقت: اپريل-06-2023
