ڪالم لڳايو

ڪالمن جي پلگ ٿيڻ کان پوء، آر اين اي جي پيداوار گھٽجي ويندي آهي يا آر اين اي کي صاف ڪرڻ ناممڪن آهي، ۽ حاصل ڪيل آر اين اي ماس گهٽ آهي.

عام سببن جو تجزيو:

1. نموني وقفو مڪمل نه آهي.

نموني جي ڀڃڪڙي مڪمل طور تي ڊي اين اي-ڪليننگ ڪالمن کي بلاڪ ٿيڻ جو سبب ناهي، جڏهن ته آر اين اي جي پيداوار ۽ معيار کي متاثر ڪري ٿو.اسان سفارش ڪريون ٿا تيز پيسڻ واري آپريشن کي ڪافي مائع نائٽروجن ۾ جڏهن توهان نمونن کي ٽوڙيو، نموني سيل جي ڀت، سيل جھلي ۽ ٻين بافتن کي ڪٽڻ جي ڪوشش ڪريو.پوليول پولي سيڪرائڊس جي ٻوٽن جي نمونن لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توھان پلانٽ ٽوٽل RNA Isolation KIT PLUS استعمال ڪريو.

2. جڏهن ڊي اين اي-ڪليننگ ڪالمن سان الڳ ٿيل نموني سپرنيٽنٽ کي سکشن ڪيو وڃي، ممڪن سيل جي ٽڪرا ٽڪرا ٿي سگهي ٿو سانس.

سيل جا ٽڪرا ٽڪرا ٽڪرا ٿي ويندا RNA-ONLY ڪالمن جو سبب بڻجندو جيڪو بلاڪ ڪيو ويندو جڏهن RNA جذب آپريشن ڪيو ويندو (ڏسو قدم 6).اسان توهان کي احتياط سان صلاح ڏيو ٿا جڏهن هن سپرنٽنٽ کي چوسڻ کان بچڻ لاءِ سيل ملبي کي چوسڻ کان پاسو ڪيو وڃي.

3. نموني جي شروعاتي رقم تمام گهڻي آهي.

وڌيڪ نموني استعمال ڪرڻ جي نتيجي ۾ بفر PSL1 پاران نامڪمل نموني جي ٽڪراءَ يا نامڪمل سيل ليسس جو نتيجو ٿيندو، جنهن جي نتيجي ۾ صفائي جي دوران صفائي واري ڪالمن ۾ رڪاوٽ پيدا ٿيندي.پلانٽ ٽوٽل آر اين اي آئسوليشن کٽ هر هڪ صاف ٿيل آپريٽنگ نمونو 50 ملي گرام آهي.پوليول پوليسڪرائڊس جي ٻوٽن جي نمونن لاءِ، اسان صلاح ڏيون ٿا ته توھان ڪوشش ڪريو Plant Total RNA Isolation KIT PLUS.

4. سينٽرفيوج جو گرمي پد تمام گهٽ آهي.

سڄو آر اين اي اڪيلائي ۽ صاف ڪرڻ وارو عمل ڪمري جي حرارت تي ڪيو ويندو آهي (20-25°سي)، سواءِ ان جي ته نموني جو ٽشو مائع نائٽروجن سان ٽوڙيو وڃي ٿو. ڪجهه ڪرائيوجنڪ سينٽرفيوجز جو گرمي پد 20 کان گهٽ آهي.℃، جيڪو شايد ڊي اين اي-ڪليننگ ڪالمن ۽/يا آر اين اي-فقط ڪالمن جي رڪاوٽ جو سبب بڻجي سگھي ٿو.جيڪڏهن ائين ٿئي ٿي، سينٽرفيوج جي درجه حرارت کي 20-25 تائين مقرر ڪريو℃، ۽پڪ ڪريو ته ليسس مرکب ۽ / يا ايٿانول شامل ڪيل سپرنيٽنٽ کي 37 تائين اڳ ۾ گرم ڪيو ويو°C.

ڪوبه آر اين اي ڪڍيو ويو يا آر اين اي جي پيداوار گهٽ ناهي

عام طور تي ڪيترائي عنصر آھن جيڪي وصولي جي ڪارڪردگي کي متاثر ڪن ٿا، جھڙوڪ: نمونو آر اين اي مواد، آپريشن جو طريقو، ايليوشن حجم، وغيره.

هيٺ ڏنل عام سببن جو تجزيو:

1. آپريشن دوران برف جو غسل يا گھٽ درجه حرارت (4 ° C) سينٽرفيوگريشن ڪيو ويو.

صلاح: ڪمري جي حرارت تي ڪم ڪريو (15-25°ج) سڄي عمل ۾، برف غسل ۽ گهٽ درجه حرارت سينٽرفيوگريشن نه ڪريو.

2. آر اين اي کي خراب ڪيو ويو آهي ڇاڪاڻ ته نموني جي غلط بچاء يا نموني جي ڊگهي مدت جي بچاء جي ڪري.

سفارش: تازو گڏ ڪيل نمونن کي جلدي مائع نائٽروجن ۾ منجمد ڪيو وڃي، ۽ پوءِ -80 ° C تي گهڻي وقت تائين ذخيرو ڪيو وڃي، نمونن کي بار بار منجمد ڪرڻ ۽ پگھلائڻ کان پاسو ڪيو وڃي؛يا فوري طور تي نمونن کي آر اين اي اسٽيبلائيزر RNAlater حل (جانورن جا نمونا) ۾ وجھو.

3. ناکافي نموني ورهائڻ ۽ ليسس صاف ڪرڻ واري ڪالمن جي بلاڪ ٿيڻ جو سبب بڻجن ٿا.

صلاح: ٽشو کي پيس ڪرڻ وقت، مھرباني ڪري پڪ ڪريو ته ٽشو ڪافي زمين تي آھي، ۽ ان کي جلدي اڳي تيار ڪيل بفر PSL1 ڏانھن منتقل ڪريو (تصديق ڪريو ته β-ME جو صحيح تناسب شامل ڪيو ويو آھي، عمل جو مرحلو 1 ڏسو).

4. ايليوئنٽ غلط شامل ڪيو ويو.

صلاح: پڪ ڪريو ته RNase-Free ddH2O کي صاف ڪرڻ واري ڪالمن جي جھلي جي وچ ۾ اڇلايو ويو آهي.

5. مطلق ايٿانول جو صحيح مقدار بفر PSL2 يا بفر PRW2 ۾ شامل نه ڪيو ويو.

صلاح: مھرباني ڪري ھدايتن تي عمل ڪريو، Buffer PSL2 ۽ Buffer PRW2 ۾ مطلق ايٿانول جو صحيح مقدار شامل ڪريو ۽ کٽ استعمال ڪرڻ کان اڳ چڱي طرح ملايو.

6. ٽشو نموني جي مقدار نامناسب آهي.

صلاح: استعمال ڪريو 50 ملي گرام ٽشو في 500 μl بفر PSL1 جي.تمام گھڻو ٽشو استعمال ڪرڻ سان نڪتل RNA جو مقدار گھٽجي ويندو ۽ نتيجي ۾ نڪرندڙ RNA جي پاڪائي به گھٽجي ويندي.اسان سختي سان صلاح ڏيو ٿا ته ابتدائي نموني جي دوز 50 ملي گرام في آر اين اي ڪڍڻ واري آپريشن کان وڌيڪ نه هجڻ گهرجي.

7. نامناسب ايليوشن حجم يا نامڪمل اخراج.

صلاح: صاف ڪرڻ واري ڪالمن جو ايلوئنٽ حجم 50-200 μl آهي.جيڪڏهن ايليوشن جو اثر اطمينان بخش نه آهي، ته اڳي گرم ٿيل RNase-Free ddH2O، جهڙوڪ 5-10 منٽ شامل ڪرڻ کان پوءِ ڪمري جي حرارت تي وقت وڌائڻ جي سفارش ڪئي وئي آهي.

8. صاف ڪرڻ واري ڪالمن ۾ BufferPRW2 سان ڌوئڻ کان پوءِ ايٿانول جي رهجي وئي آهي.

تجويز: جيڪڏهن خالي ٽيوب 1 منٽ لاءِ سينٽرفيوگر ٿي وڃي ۽ بفر PRW2 ۾ ڌوئڻ کان پوءِ به ايٿانول باقي آهي، ته توهان خالي ٽيوب سينٽرفيوگريشن جو وقت 2 منٽ تائين وڌائي سگهو ٿا، يا صاف ڪرڻ واري ڪالم کي ڪمري جي حرارت تي 5 منٽ لاءِ رکي سگهو ٿا ته جيئن باقي بچيل ايٿانول کي مڪمل طور تي هٽايو وڃي.

9. کٽ غلط استعمال ڪيو ويو.

صلاح: ٻوٽن جي نموني لاءِ پولي فينولڪ پولي سيڪرائڊس، عام ڪِٽ استعمال ڪندي جيئن ته پلانٽ ٽوٽل آر اين اي آئسوليشن کٽ مثالي آر اين اي نموني حاصل ڪرڻ جي قابل نه هوندا.اسان توهان کي پلانٽ ٽوٽل آر اين اي آئسوليشن ڪٽ پلس استعمال ڪرڻ جي صلاح ڏيو ٿا، جيڪو خاص طور تي پولي فينولڪ پوليسڪچرائيڊ پلانٽ جي نمونن لاءِ ٺهيل آهي.پوليفينول ۽ پولي سيڪريڊ پلانٽ جي نمونن مان آر اين اي ڪڍڻ لاءِ خاص طور تي تيار ڪيل کٽ.

OD260/OD280 قدر گھٽ آھي

ddH2O سان آر اين اي ايليوشن ۽ اسپيڪٽرفوٽوميٽر ريڊنگز لاءِ استعمال ٿيل نتيجا گھٽ OD260/OD280 قدرن ۾.اسان 10 mM Tris-HCl، pH 7.5 استعمال ڪرڻ جي صلاح ڏيون ٿا (RNase-Free ddH2O بجاءِ RNA کي ختم ڪرڻ لاءِ) نسبتاً صحيح OD260/OD280 قدر حاصل ڪرڻ لاءِ، ڏسو ”RNA ڪنسنٽريشن اينڊ پيوريفڪيشن اسيس“ صفحي 19 تي.

صاف ٿيل آر اين اي خراب ٿي وئي آهي

صاف ٿيل آر اين اي جي معيار جو تعلق عنصرن سان آهي جهڙوڪ نموني تحفظ، RNase آلودگي، ۽ هٿرادو.

عام سببن جو تجزيو:

1. ٽشو جا نمونا گڏ ڪرڻ کان پوء وقت ۾ محفوظ نه ڪيا ويا.

تجويز: جيڪڏهن ٽشو جا نمونا گڏ ڪرڻ کان پوءِ وقت تي استعمال نه ڪيا ويا آهن، مهرباني ڪري انهن کي فوري طور تي مائع نائٽروجن ۾ گهٽ درجه حرارت تي ذخيرو ڪريو يا مائع نائٽروجن ۾ جلدي منجمد ٿيڻ کان پوءِ ڊگھي مدت جي اسٽوريج لاءِ -80 ° C تي منتقل ڪريو، يا فوري طور تي نمونن کي RNA اسٽيبلائزر RNAlater محلول (جانورن جا نمونا) ۾ وجھو.آر اين اي ڪڍڻ لاء، تازو گڏ ڪيل ٽشو نموني استعمال ڪرڻ جي ڪوشش ڪريو.

2. ٽشو جي نمونن کي بار بار منجمد ڪرڻ ۽ thawing.

صلاح: ٽشو جي نمونن کي ذخيرو ڪرڻ وقت، اهو بهتر آهي ته انهن کي محفوظ ڪرڻ لاء ننڍن ٽڪرن ۾ ڪٽي، ۽ انهن کي استعمال ڪرڻ وقت انهن مان هڪ حصو ڪڍيو وڃي ته جيئن نمونن کي بار بار منجمد ڪرڻ ۽ گلڻ سبب RNA جي خراب ٿيڻ کان بچڻ لاء.

3.RNase آپريشن روم ۾ متعارف ڪرايو ويو آهي يا نه پائڻ وارو ڊسپوزيبل دستانو، ماسڪ وغيره.

تجويز: آر اين اي ڪڍڻ جا تجربا الڳ الڳ آر اين اي آپريشنز ۾ بهترين طور تي ڪيا وڃن ٿا، ۽ تجربي کان اڳ ليبارٽري ٽيبل کي صاف ڪيو وڃي، ۽ تجربي دوران ڊسپوزيبل دستانو ۽ ماسڪ پائڻ گهرجن ته جيئن آر اين اي جي تباهيءَ کان بچي سگهجي، جيڪا تمام گهڻي حد تائين RNase جي متعارف ٿيڻ جي ڪري ٿي.

4.The reagent استعمال دوران RNase پاران آلوده آهي.

تجويز: لاڳاپيل تجربن لاءِ ٻوٽن جي ٽوٽل آر اين اي ايڪسٽريشن ڪٽس جي نئين سيريز سان مٽايو.

5. آر اين اي جي ڦيرڦار لاءِ استعمال ٿيندڙ سينٽريفيوج ٽيوب ۽ پائپٽ جون ٽوپيون RNase سان آلوده آهن.

صلاح: پڪ ڪريو ته آر اين اي ڪڍڻ ۾ استعمال ٿيندڙ سينٽرفيوج ٽيوب، پائيپٽ ٽائيپ، پائپيٽ وغيره سڀ RNase-Free آهن.

هدايتون:

پلانٽ ٽوٽل آر اين اي آئسوليشن ڪٽ پلس ھدايت وارو دستور