1. آر اين اي حل جي جذب کي ڳوليو
280، 320، 230، ۽ 260 nm تي جذب نيڪلڪ ايسڊ، پس منظر (حل turbidity)، لوڻ جي ڪنسنٽريشن، ۽ نامياتي مادو جهڙوڪ پروٽين جي قدرن جي نمائندگي ڪري ٿو.عام طور تي صرف OD260/OD280 (Ratio, R) تي نظر اچن ٿا.جڏهن 1.8 ~ 2.0، اسان سمجهون ٿا ته آر اين اي ۾ پروٽين يا ٻي نامياتي مادي جي آلودگي کي برداشت ڪري سگهجي ٿو، پر اهو ياد رکڻ گهرجي ته جڏهن ٽريس کي بفر طور استعمال ڪيو ويندو آهي جذب کي ڳولڻ لاء، R جي قيمت 2 کان وڌيڪ ٿي سگهي ٿي (عام طور تي اهو هجڻ گهرجي <2.2).جڏهن R <1.8، حل ۾ پروٽين يا ٻي نامياتي مادي جي آلودگي وڌيڪ واضح آهي، ۽ آر اين اي جي قسمت جي ضرورت مطابق طئي ڪري سگهجي ٿو.جڏهن R> 2.2، ان جو مطلب اهو آهي ته آر اين اي کي هائيڊولائيز ڪيو ويو آهي اڪيلو نيوڪلڪ ايسڊ ۾.
2. آر اين اي جو اليڪٽروفورٽيڪ نمونو
عام طور تي آر اين اي الیکٹروفورسس لاءِ ڊينيچرنگ جيل استعمال ڪيو ويندو آهي، پر جيڪڏهن اهو صرف آر اين اي جي معيار کي معلوم ڪرڻ لاءِ هجي، ته ڊينيچرنگ جيل ضروري ناهي، ۽ عام ايگرز جيل استعمال ڪري سگهجي ٿي.اليڪٽرروفورسس جو مقصد 28S ۽ 18S بئنڊ جي سالميت ۽ انهن جي تناسب، يا mRNA سمير جي سالميت کي ڳولڻ آهي.عام طور تي، جيڪڏهن 28S ۽ 18S بينڊ روشن، صاف ۽ تيز آهن (بينڊن جي ڪنارن ڏانهن اشارو ڪندي واضح آهن)، ۽ 28S جي روشني 18S بينڊ جي ڀيٽ ۾ ٻه ڀيرا وڌيڪ آهي، اسان آر اين اي جي معيار کي سٺو سمجهون ٿا.
مٿي ڄاڻايل ٻه طريقا آهن جيڪي اسان عام طور تي استعمال ڪندا آهيون، پر انهن ٻنهي طريقن مان ڪو به واضح طور تي اسان کي ٻڌائي نٿو سگهي ته ڇا RNA محلول ۾ باقي RNase موجود آهي.جيڪڏهن حل ۾ RNase جي تمام گھٽ مقدار موجود آهي ته اسان لاءِ مٿي ڄاڻايل طريقي سان ان کي ڳولڻ ڏکيو آهي، پر ان کان پوءِ ايندڙ اڪثر اينزيميٽڪ رد عمل 37 ڊگرين کان مٿي ۽ گهڻي وقت تائين ڪيو ويندو آهي.اهڙي طرح جيڪڏهن آر اين اي محلول ۾ RNase جي تمام گھٽ مقدار موجود هوندي ته پوءِ ايندڙ تجربن ۾ پنهنجو ڪردار ادا ڪرڻ لاءِ ڪافي مناسب ماحول ۽ وقت هوندو ۽ يقيناً هن وقت تجربو ٿڌو هوندو.هيٺ اسان هڪ طريقو متعارف ڪرايو ٿا جيڪو تصديق ڪري سگهي ٿو ته ڇا آر اين اي حل ۾ باقي RNase موجود آهي.
3. گرميءَ جي بچاءَ جا امتحان
نموني ڪنسنٽريشن جي مطابق، آر اين اي محلول مان ٻه 1000 ng RNA ڪڍو ۽ ان کي 0.5 ml سينٽرفيوج ٽيوب ۾ شامل ڪريو، ۽ ان کي pH 7.0 ٽريس بفر سان گڏ ڪريو مجموعي حجم 10 ul، ۽ پوء ٽيوب جي ڪيپ کي سيل ڪريو.انهن مان هڪ کي مسلسل گرمي پد جي پاڻيء جي غسل ۾ 70 ° C تي رکو ۽ ان کي 1 ڪلاڪ لاء گرم رکو.ٻيو حصو 1 ڪلاڪ لاءِ -20 ° سي فرج ۾ محفوظ ڪيو ويو.جڏهن وقت ختم ٿي ويو آهي، اليڪٽرروفورسس لاء ٻه نمونا هٽايو.اليڪٽرروفورسس مڪمل ٿيڻ کان پوءِ، ٻنھي جي اليڪٽرروفوريٽڪ بينڊ جو مقابلو ڪريو.جيڪڏهن ٻنهي جا بينڊ هڪجهڙا آهن يا انهن ۾ ڪو خاص فرق نه آهي (يقيناً، انهن جا بينڊ به طريقا 2 جي شرطن کي پورا ڪن ٿا)، ان جو مطلب آهي ته RNA محلول ۾ ڪو به بقايا RNase آلودگي نه آهي، ۽ RNA جو معيار تمام سٺو آهي.ان جي برعڪس، جيڪڏهن نمونو 70 ° C تي پکڙيل آهي ته واضح خرابي ڏيکاري ٿي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته RNA محلول ۾ RNase آلودگي آهي.
2 آر اين اي ڪڍڻ لاءِ تجرباتي طريقا ۽ ٽيڪنڪ
آر اين اي ڪڍڻ وقت اسان کي اڪثر مسئلا درپيش اچن ٿا: (1) آر اين اي جي پيداوار گهٽ آهي؛(2) آر اين اي ۾ سنگين لوڻ آلودگي آهي؛(3) آر اين اي ۾ سنگين نامياتي محلول آلودگي آهي؛(4) نموني جي خرابي ۽ ٻيا مسئلا
1. عام طور تي استعمال ٿيل ڪل آر اين اي ڪڍڻ وارا ريجنٽ
guanidine isothiocyanate طريقو ۽ Trizol طريقو سڀ کان وڌيڪ عام طور تي استعمال ٿيل طريقا آھن ڪل آر اين اي کي جانورن جي بافتن ۽ جانورن جي سيلن مان ڪڍڻ لاء.اهو خاص طور تي ننڍڙن نمونن ۽ بافتن لاءِ موزون آهي، جن کي ڪڍڻ خاص مشڪل آهي، جيئن ته خرگوش جي چمڙي ۽ جانورن جي ڳنڍيندڙ بافتن مان ڪل آر اين اي ڪڍڻ؛ان کان علاوه، Trizol، هڪ عام-مقصد lysis reagent جي طور تي، پڻ ٻوٽن جي بافتن، بيڪٽيريا، fungi ۽ ٻين بافتن جي extraction لاء استعمال ڪري سگهجي ٿو.ٻوٽن جي بافتن لاءِ جن ۾ پولي سيڪرائڊس ۽ پوليفينول شامل آهن، جهڙوڪ ڪيميليا اوليفيرا، چانهه جي پنن، ريپسيڊ وغيره، ڪل آر اين اي ڪڍڻ لاءِ به CTAB طريقو استعمال ڪري سگهجي ٿو.
روايتي طريقي جي طور تي، ڊبل ڪالمن جو طريقو پڻ تمام گهڻو مشهور آهي ان جي عام درجه حرارت جي آپريشن جي ڪري، RNase شامل ڪرڻ جي ڪا ضرورت ناهي، ۽ حفاظت - نڪرندڙ لاء ڪلوروفارم، فينول ۽ ٻيا نامياتي ريجنٽ.(سفارش ٿيل مصنوعات )
2. جانورن جي بافتن مان ڪل آر اين اي جو اخراج
(1) تازو ٽشو چونڊڻ جي ڪوشش ڪريو، جيڪڏھن اھو تازو نه آھي (ترجيح طور تي ٽن مھينن اندر - 80 ℃ فرج ۾ يا مائع نائٽروجن ۾ منجمد. ٽشو کي ڪٽڻ وقت، سڌو ڪمري جي حرارت تي نه ڪٽيو، پڪ ڪريو ته ان کي برف جي دٻي تي رکو، بار بار منجمد ٿيڻ ۽ ٿڪڻ کان بچڻ جي ڪوشش ڪريو.
(2) ٽشو جي ننڍڙي ٽڪري کي ڪٽڻ لاءِ صاف اسڪيسر ۽ ٽائيزر استعمال ڪريو، نموني کي ڪٽڻ وقت ٽشو جي مرڪزي حصي کي ڪٽڻ جي ڪوشش ڪريو، يا پهرين ٽشو جي وڏي ٽڪري کي وچ مان ڪٽي، ۽ پوءِ نموني کي تازو چيري واري پوزيشن تي ڪٽيو.هٽايل ٽشو کي مڪمل طور تي ڇڪايو وڃي، ڇڪيل ٽشو کي EP ٽيوب ۾ وجهي بغير RNase جي، lysate شامل ڪريو، ڇڪيل ٽشو کي مڪمل طور تي lysate جي سامهون اچڻ گهرجي، ۽ هڪجهڙائي لاء تيار ڪيو وڃي.
(3) نارمل ٽشوز لاءِ، مونگ بئن جي سائيز جي ٽشوز (30-60 mg) کي هڪجهڙائي لاءِ چونڊيو.جيڪڏهن ٽشوز ۾ وڏي مقدار ۾ پروٽين، ٿلهي، يا ٿلهي فائبر واري ٽشوز جهڙوڪ جگر، مناسب طور تي ڪٽ ٽشوز جي مقدار کي وڌايو يا گھٽايو (اختياري) چونڊيو 10~20 mg).
(4) جيڪڏهن مڇيءَ جو عضلتون، جهنگ جو گوشت، جيلي فش ۽ ٻيون ٽشوز جن ۾ پاڻيءَ جو مقدار وڌيڪ هجي، ته نموني جي مقدار کي مناسب طور تي وڌايو وڃي (سفارش ڪيل 100-200 ملي گرام).
(5) جيڪڏهن حالتون اجازت ڏين ته، جانور جي ٽشو کي سڌو سنئون ڪڍي سگهجي ٿو هوموجنائيز ٿيڻ کان پوءِ هاءِ پاسج ٽشو هوموجنائيزر سان، جيڪڏهن اهڙو سامان نه هجي.
(6) حتمي ڪڍڻ کان پوءِ حاصل ڪيل آر اين اي کي فوري طور تي آئس باڪس تي رکڻو پوندو ته جيئن آر اين اي جي تباهي کي گهٽائي سگهجي.
3. جانورن جي سيل آر اين اي ڪڍڻ
(1) معطلي سيلز: سينٽرفيوج سڌو سنئون ۽ وچولي کي رد ڪريو، جراثيم کان پاڪ PBS سان 1-2 ڀيرا ڌوء، پوء PBS جي مناسب مقدار سان معطل ڪريو، ۽ پوء lysis لاء lysate شامل ڪريو.مائع کي مڪمل طور تي رد ڪرڻ کان پوءِ lysate کي سڌو سنئون سيلز ۾ شامل نه ڪريو.اهو سبب بڻجندو هسٽون پيڪيج جي ٻاهرئين پرت تي ليز ٿيل سيلز کان پوءِ جاري ٿيل سيلز جي ٻاهرئين حصي تي چڙهڻ لاءِ ، ان ڪري lysate سان pellet اندر سيلن جي رابطي کي محدود ڪري ڇڏيندو.جنهن جي نتيجي ۾ نامڪمل سيل ليسس ۽ آر اين اي جي پيداوار گهٽجي ٿي.
(2) سيلز جيڪي نيم لڳل هوندا آهن يا مضبوطيءَ سان نه هوندا آهن: ميڊيم کي رد ڪرڻ کان پوءِ، PBS سان 1-2 ڀيرا ڌوئو، پوءِ سڌو سنئون PBS جي مناسب مقدار کي جذب ڪريو ۽ ڪلچر ڊش کي پائيپٽ يا بندوق سان اڏايو ته جيئن سيلز کي اُڇلي، ۽ انهن کي آر اين اي فري سيلز ڏانهن منتقل ڪيو وڃي.اينزيم جي اي پي ٽيوب ۾ lysate شامل ڪريو اضافي لاء.
(3) Adherent Cells: پهرين ٽرپسن سان هضم ٿيڻ جي ضرورت آهي، پوءِ RNase-free EP tubes ۾ گڏ ڪيو وڃي ٿو، سپرنيٽنٽ کي هٽائڻ لاءِ سينٽريفيوز ڪيو وڃي ٿو، اضافي ٽريپسن کي هٽائڻ لاءِ PBS سان 1-2 ڀيرا ڌويو وڃي ٿو، ۽ PBS جي مناسب مقدار سان بحال ڪيو وڃي ٿو، پوءِ ڪڍڻ واري مرحلي ڏانهن اڳتي وڌو.
4. ٻوٽو آر اين اي ڪڍڻ
ٻوٽن جا ٽشوز فينولڪ مرکبات ۾ مالا مال آهن، يا پولي سيڪرائڊس ۾ مالا مال آهن، يا ڪجهه اڻ ڄاتل ثانوي ميٽابولائٽس تي مشتمل آهن، يا RNase جي اعليٰ سرگرمي آهي.اهي مادا سيل ليسس کان پوءِ آر اين اي سان مضبوطيءَ سان ملن ٿا ته جيئن ناقابل حل ڪمپليڪس يا ڪولائيڊل پريپيٽيٽس ٺهي، جن کي هٽائڻ مشڪل آهي.تنهن ڪري، جڏهن اسان ٻوٽي جي نسب کي ڪڍو ٿا، اسان کي ٻوٽن لاء هڪ کٽ چونڊڻ جي ضرورت آهي.کٽ ۾ موجود lysate مؤثر طريقي سان پوليفينول جي آسان آڪسائيڊشن ۽ پوليسڪچرائيڊ مرکبات ۽ نيوڪليڪ اسيد جي الڳ ٿيڻ جي مسئلن کي حل ڪري سگهي ٿو.
(Polysaccharide polyphenol پلانٽ RNA ڪڍڻ لاءِ، تجويز ڪيل مصنوعات:
(1) ٻوٽي جي ڇل، گود، ٻج، پنن وغيره کي مارٽر ۾ پوريءَ طرح پسيو وڃي.پيسڻ جي عمل دوران، نموني کي پگھلڻ کان بچڻ لاء مائع نائٽروجن کي وقت ۾ ڀريو وڃي.زمين جي نموني کي جلدي lysate ۾ شامل ڪيو وڃي ۽ RNA جي تباهي کان بچڻ لاءِ ڇڪيو وڃي.
(2) فائبر سان مالا مال نمونن جهڙوڪ چانور ۽ ڪڻڪ جي پنن لاءِ، اضافي جي مقدار کي مناسب طور تي گھٽايو وڃي، ٻي صورت ۾ ٽشو گرائننگ ۽ ليسس مڪمل نه ٿيندا، نتيجي ۾ نڪتل آر اين اي جي گھٽ پيداوار ٿيندي.
(3) ٻوٽن جي بافتن لاءِ جن ۾ پاڻي جو مقدار وڌيڪ هجي، جهڙوڪ انار ميوو، تربوز ميوو، آڑو ميوو وغيره، نموني جي سائيز کي مناسب طور تي وڌايو وڃي (100-200 ملي گرام اختياري آهي).
(4) ٻوٽن جي بافتن، جهڙوڪ ٻوٽن جي پنن، rhizomes، سخت ميوو ۽ ٻين مواد کي عام طور تي مائع نائٽروجن استعمال ڪرڻ جي صلاح ڏني وئي آهي ته مواد کي مارٽر ۾ چڱي طرح مارٽر، ۽ پوء ڪڍڻ واري مرحلي ڏانهن وڌو.روايتي ٽشو هوموجنائيزر ٻوٽن جي بافتن کي هڪجهڙائي ڪرڻ ۾ اثرائتو نه هوندا، ۽ عام طور تي سفارش نه ڪئي وئي آهي.
5. آر اين اي ڪڍڻ لاءِ احتياطي تدبيرون
(1) ٽشو جا نمونا ممڪن حد تائين تازو هجڻ گهرجن ته جيئن بار بار منجمد ٿيڻ ۽ پگھلڻ کان بچڻ لاءِ.
(2) ڪڍڻ دوران ٽشو کي مڪمل طور گرائونڊ ٿيڻ گهرجي، ۽ ٽشو جي مقدار تمام گهٽ نه هجڻ گهرجي، تمام گهڻو ڇڏي ڏيو.
(3) نموني کي مڪمل طور تي ليس ڪرڻ لاءِ lysate شامل ڪرڻ کان پوءِ ڪافي انڪيوبيشن وقت ڏنو وڃي.
(4) ڪڍڻ لاءِ Trizol جو طريقو استعمال ڪرڻ وقت، سطحي ٿيڻ کان پوءِ سپرنيٽنٽ کي جذب ڪرڻ جو اصول آهي ”وڌيڪ ساهه کڻڻ کان گهٽ ساهه کڻڻ کي ترجيح ڏيو“ ۽ وچين پرت تائين نه ڪڍڻ گهرجي، ٻي صورت ۾ اهو سنجيده جينومڪ ڊي اين اي آلودگي جو سبب بڻجندو.
(5) ڌوئڻ دوران، ڌوئڻ واري مائع کي مڪمل طور تي ٽيوب جي ڀت جي چوڌاري ڦهلائڻ گهرجي ته جيئن چڱي طرح ڌوئڻ کي يقيني بڻائي سگهجي.
(6) ڪالمن کي ڪڍڻ واري طريقي لاءِ، ڪالمن کي ڌوئڻ کان پوءِ الڳ ڪرڻ کان علاوه، جذب ڪرڻ واري ڪالمن کي به الٽرا ڪلين بينچ ۾ رکڻ گهرجي ۽ 5-10 منٽن لاءِ ڦوڪيو وڃي ته جيئن نامياتي محلول کي مڪمل طور سڪي وڃي.
(7) ڪالمن واري طريقي جي آخري ايليوشن تي، DEPC پاڻي شامل ڪرڻ کان پوءِ، ان کي 3-5 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو وڃي، يا DEPC پاڻي کي اڳ ۾ ئي 60°C تي گرم ڪيو وڃي ته جيئن ايليوشن جي پيداوار کي وڌايو وڃي.روايتي Trizol cleavage ۽ isopropanol precipitation طريقي ۾، آخري RNA کي DEPC پاڻيءَ ۾ گھليو ويندو آھي، تنھنڪري گھلڻ لاءِ مناسب وقت ڏنو وڃي، ۽ سينٽريفيوج ٽيوب جي ھيٺئين حصي کي پائيپٽ ٽپ سان مسلسل ڦوڪيو وڃي.
3 ٽيگھٽ آر اين اي ڪنسنٽريشن/خراب معيار جا سبب ۽ حل
1. پيداوار تمام گهٽ آهي
ڪڍيل نمونو تمام گهٽ آهي، مجموعي رقم ڪافي نه آهي، يا ڪڍيل نمونو تمام گهڻو آهي ۽ ليسس مڪمل نه آهي؛مناسب معيار جي ٽشو يا سيلز کي ڪڍڻ لاء استعمال ڪيو وڃي، نموني جي اڳوڻي علاج کي چڱي طرح ڪيو وڃي، ۽ ليسس ڪافي هجڻ گهرجي.
2. جينوم جي باقيات
جڏهن Trizol طريقي سان ڪڍيو ويندو آهي، جڏهن سپرنيٽنٽ ليئرنگ کان پوء وچين پرت ۾ چوسي ويندي آهي، سنجيده جينوم آلودگي جو سبب بڻجندو؛وچين پرت ۾ چوسڻ کان بچڻ لاءِ پرت ڪرڻ وقت اضافي خيال رکڻ گهرجي.جيڪڏهن ڪالمن جو طريقو استخراج لاءِ استعمال ڪيو وڃي ته، DNase I تي مشتمل هڪ کٽ ڪڍي ڪڍڻ لاءِ چونڊيو وڃي ٿو.جھلي تي جذب ٿيل نيوڪليڪ ايسڊ سڌو سنئون DNase I سان ھضم ڪيو ويندو آھي، جيڪو ڊي اين اي جي باقيات کي تمام گھٽ گھٽائي سگھي ٿو.
3. آر اين اي جي تباهي
اهو ٿي سگهي ٿو پاڻ کي ڪڍيل نموني جي تباهي، يا خارج ٿيڻ واري عمل جي دوران پيدا ٿيل خرابي؛جيترو ٿي سگهي، تازو نمونو آر اين اي ڪڍڻ لاءِ استعمال ڪيو وڃي، ۽ گڏ ڪيل نمونن کي وقت ۾ مائع نائٽروجن يا -80 ° سي فرج ۾ محفوظ ڪيو وڃي، ۽ بار بار منجمد ٿيڻ ۽ پگھلڻ کان پاسو ڪيو وڃي.RNase/DNase مفت ٽوٽڪا، سينٽرفيوج ٽيوب ۽ ٻيو مواد استعمال ڪيو وڃي آر اين اي ڪڍڻ واري عمل ۾.ڪڍڻ جي عمل کي ممڪن طور تي تيز هجڻ گهرجي.ڪڍيل آر اين اي کي برف جي دٻي تي رکڻ گهرجي ۽ وقت ۾ -80 تي ذخيرو ڪيو وڃي.جيڪڏهن ڪڍيل آر اين اي کي جيل الیکٹروفورسس ذريعي ڳولڻ جي ضرورت آهي، اليڪٽرروفورسس کي ڪڍڻ کان پوء فوري طور تي انجام ڏيڻ گهرجي، ۽ اليڪٽرروفورسس بفر کي نئين تيار ڪيل هڪ سان تبديل ڪيو وڃي.
4. لوڻ ۽ نامياتي محلول جي باقيات
ڪڍڻ واري ريجن ۾ فينول ۽ گيانڊين لوڻ شامل آهن، ۽ ڌوئڻ جي حل ۾ ايٿانول شامل آهن.ڪڍڻ واري عمل دوران، lysate مڪمل طور تي جذب ۽ رد نه ڪيو ويو، ۽ ڌوئڻ جو حل مڪمل طور تي خشڪ نه ڪيو ويو.باقي بچيل لوڻ ۽ نامياتي محلول ايندڙ ريورس ٽرانسپشن ۽ پي سي آر لاءِ نقصانڪار آهن.رڪاوٽ جا مختلف درجا، تنهنڪري ٽشو ليسٽ کي ڪڍڻ جي عمل دوران مڪمل طور تي هٽايو وڃي، ۽ ڌوئڻ ڪافي هجڻ گهرجي ته جيئن ٽيوب جي چوڌاري ڀتين کي ڌوئي سگهجي.ان کان علاوه، ٽيوب کي خالي ڪيو ويو آهي ۽ ڦوڪيو هڪ ضروري قدم آهي، جيڪو وڌيڪ نامياتي مادي جي رهائش کي گهٽائيندو.
آر اين اي ڪڍڻ بابت وڌيڪ معلومات لاء، مهرباني ڪري اسان جي ويب سائيٽ تي عمل ڪريو:
www.foreivd.com وڌيڪ معلومات لاء.
پوسٽ ٽائيم: ڊسمبر-01-2022
