اهو مشهور آهي ته مرڪزي ڪٿا ۾، آر اين اي ڊي اين اي ۽ پروٽين جي اظهار جي وچ ۾ ٽرانسپشن ثالث آهي.ڊي اين اي جي ڳولها جي مقابلي ۾، آر اين اي جي ڳولا وڌيڪ معقول طور تي جاندارن ۾ جين جي اظهار کي ظاهر ڪري سگهي ٿي.آر اين اي ۾ شامل تجربا شامل آهن: qRT-PCR، RNA-Seq، ۽ فيوزن جين جو پتو لڳائڻ، وغيره. RNA جي خاصيتن جي بنياد تي (RNA جي شگر جي رنگ ۾ DNA جي شگر رنگ جي ڀيٽ ۾ هڪ وڌيڪ آزاد هائيڊروڪسيل گروپ آهي)، ماحول ۾ وڏي تعداد ۾ RNases سان گڏ، RNA وڌيڪ غير مستحڪم آهي ۽ ڊي اين اي کان وڌيڪ آسان آهي.گندگي اندر، ڪچرو ٻاهر نڪرڻ، جيڪڏهن آر اين اي جو معيار سٺو نه آهي، ته تجرباتي نتيجا غير اطمينان بخش هجڻ گهرجن، خاص طور تي ظاهر ڪيل غلط ڊيٽا يا خراب ورجائي قابليت جي طور تي.تنهن ڪري، آر اين اي جي پروسيسنگ تي وڌيڪ ڌيان ڏيڻ گهرجي، ۽ بعد ۾ تجرباتي ڊيٽا جي درستگي ۽ درستگي کي يقيني بڻائڻ لاء معيار ڪنٽرول جي لنڪ پڻ وڌيڪ اهم آهي.

آر اين اي جي معيار جي ڪنٽرول لاء، عام طور تي هيٺيان عام طور تي استعمال ٿيل طريقا آهن:

• اسپيڪٽرفوٽوميٽري
• agarose gel electrophoresis
• Agilent Bioanalyzer
• حقيقي وقت فلورسنٽ مقداري پي سي آر
• ڪوبٽ فلورسنٽ رنگ جو طريقو

01 اسپيڪٽرفوٽوميٽري

آر اين اي کي ڊبل بانڊ جوڙيو ويو آهي ۽ 260nm جي موج جي ڊيگهه تي جذب جي چوٽي آهي.Lambert-Beer جي قانون جي مطابق، اسان 260nm تي جذب جي چوٽي کان آر اين اي ڪنسنٽريشن کي حساب ڪري سگھون ٿا.ان کان علاوه، اسان 260nm، 280nm ۽ 230nm جذب جي چوٽي جي تناسب جي حساب سان آر اين اي جي پاڪائي کي به حساب ڪري سگھون ٿا.280nm ۽ 230nm پروٽين ۽ ننڍڙن ماليڪيولن جي جذبي جون چوٽيون آهن.A260/A280 ۽ A260/A230 جو تناسب قابل RNA جي خالصيت جو 2 کان وڌيڪ هجڻ گهرجي. جيڪڏهن اهو 2 کان گهٽ آهي ته ان جو مطلب آهي ته RNA نموني ۾ پروٽين يا ننڍڙو ماليڪيول آلودگي آهي ۽ ان کي ٻيهر صاف ڪرڻ جي ضرورت آهي.آلودگي جا ذريعا هيٺئين دور جي تجربن تي اثرانداز ٿيندا، جيئن ته پي سي آر جي رد عمل جي امڪاني ڪارڪردگيءَ کي روڪڻ، نتيجي ۾ غلط مقداري نتيجا.آر اين اي جي پاڪائي جو ايندڙ نتيجن تي وڏو اثر آهي، تنهن ڪري اسپيڪٽروفوٽوميٽري عام طور تي نيوڪليڪ ايسڊ تجربن جي پهرين مرحلي ۾ هڪ لازمي معيار ڪنٽرول لنڪ آهي.

شڪل 1. عام RNA/DNA جذب اسپيڪٽرم

02 Agarose gel electrophoresis

خالصيت کان علاوه، آر اين اي جي سالميت پڻ آر اين اي جي معيار کي جانچڻ لاء اهم اشارن مان هڪ آهي.آر اين اي جي خراب ٿيڻ سان نموني ۾ ننڍن ننڍن ٽڪرن جي وڏي تعداد ۾ اضافو ٿيندو، تنهنڪري آر اين اي جي ٽڪڙن جو تعداد گھٽجي ويندو جيڪي مؤثر طريقي سان ڳولي سگهجن ٿا ۽ حوالن جي ترتيب سان ڍڪيل هوندا.آر اين اي جي سالميت کي 1٪ ايگرز جيل تي ڪل آر اين اي جي الیکٹروفورسس ذريعي چيڪ ڪري سگهجي ٿو.اهو طريقو توهان جيل کي ترتيب ڏئي سگهي ٿو، يا سالميت جي جاچ لاءِ اڳ ۾ ٺهيل E-Gel™ سسٽم استعمال ڪري سگهي ٿو.ڪل RNA جو 80 سيڪڙو کان وڌيڪ ribosomal RNA آهي، جنهن جي اڪثريت 28S ۽ 18S rRNA تي مشتمل آهي (ممالين جي نظام ۾).سٺي معيار جي آر اين اي ٻه واضح روشن بار ڏيکاريندو، جيڪي 28S ۽ 18S روشن بار آهن، ترتيبوار 5 Kb ۽ 2 Kb تي، ۽ اهو تناسب 2:1 جي ويجهو هوندو.جيڪڏهن اهو هڪ ڦهليل حالت ۾ آهي، ان جو مطلب اهو آهي ته آر اين اي نموني کي خراب ڪيو ويو آهي، ۽ آر اين اي جي معيار کي وڌيڪ جانچڻ لاء بعد ۾ بيان ڪيل طريقي کي استعمال ڪرڻ جي سفارش ڪئي وئي آهي.

شڪل 2. ايگرز جيل اليڪٽرروفورسس تي خراب ٿيل (لين 2) ۽ برقرار آر اين اي (لين 3) جو مقابلو

03 Agilent Bioanalyzer

مٿي بيان ڪيل agarose gel electrophoresis طريقي سان گڏوگڏ، جيڪو اسان کي آسان ۽ جلدي آر اين اي جي سالميت کي سڃاڻڻ ۾ مدد ڪري ٿو، اسان آر اين اي جي سالميت کي طئي ڪرڻ لاءِ Agilent bioanalyzer پڻ استعمال ڪري سگهون ٿا.اهو RNA ڪنسنٽريشن ۽ سالميت جو جائزو وٺڻ لاءِ مائڪرو فلائيڊڪس، ڪيپيلري اليڪٽرروفورسس، ۽ فلوروسينس جو ميلاپ استعمال ڪري ٿو.آر اين اي نموني جي پروفائل جو تجزيو ڪرڻ لاءِ ٺهيل الورورٿم استعمال ڪندي، Agilent bioanalyzer حساب ڪري سگھي ٿو هڪ حوالو آر اين اي سالميت جي قيمت، آر اين اي سالميت نمبر (هاڻي بعد ۾ RIN جو حوالو ڏنو ويو) [1].RIN جو قدر جيترو وڏو، RNA جي سالميت جيتري وڌيڪ هوندي (1 انتهائي خراب، 10 سڀ کان وڌيڪ مڪمل).ڪي تجربا جن ۾ آر اين اي شامل آهي انهن کي استعمال ڪرڻ جو مشورو ڏنو ويو آهي RIN کي معيار جي تشخيص لاءِ هڪ پيٽرول جي طور تي.مثال طور، اعلي سطحي ترتيب جي تجربن کي کڻڻ (هتي NGS جو حوالو ڏنو ويو آهي) مثال طور، Oncomine™ Human Immune Repertoire جون هدايتون، جيڪي Thermo Fisher's Oncomine پينل سيريز ۾ B cell ۽ T cell antigen receptors کي ڳولڻ لاءِ استعمال ڪيون وينديون آهن، تجويز ڪيو ته RIN ويلز سان نمونن کي 4 کان وڌيڪ اثرائتو پڙهي سگهجي ٿو، 4 کان وڌيڪ اثرائتو ۽ ماپ ڪري سگهجي ٿو.مختلف پينلز لاءِ مختلف تجويز ڪيل حدون آهن، ۽ اڪثر ڪري هڪ اعلي RIN وڌيڪ اثرائتي ڊيٽا آڻي سگهي ٿو.

شڪل 3، Oncomine™ Human Immune Repertoire تجربن ۾، 4 کان وڌيڪ RIN سان نمونا وڌيڪ اثرائتي ريڊس ۽ ٽي سيل ڪلون ڳولي سگھن ٿا.【2】

جڏهن ته، RIN قدر پڻ ڪجهه حدون آهن.جيتوڻيڪ RIN جو NGS تجرباتي ڊيٽا جي معيار سان هڪ اعلي تعلق آهي، اهو FFPE نموني لاء مناسب ناهي.FFPE نموني کي ڪيميائي طور تي علاج ڪيو ويو آهي ڊگهي وقت تائين، ۽ ڪڍيل آر اين اي عام طور تي نسبتا گهٽ RIN قدر آهي.بهرحال، هن جو مطلب اهو ناهي ته تجربي جي اثرائتي ڊيٽا غير اطمينان بخش هجڻ گهرجي.FFPE نمونن جي معيار کي صحيح انداز ۾ جانچڻ لاءِ، اسان کي استعمال ڪرڻ جي ضرورت آهي ماپن کان سواءِ RIN.RIN کان علاوه، Agilent bioanalyzer پڻ حساب ڪري سگھي ٿو DV200 قدر RNA معيار جي تشخيصي پيٽرولر جي طور تي.DV200 ھڪڙو پيٽرولر آھي جيڪو ھڪڙي آر اين اي نموني ۾ 200 بي پي کان وڏي ٽڪرن جو تناسب حساب ڪري ٿو.DV200 RIN کان FFPE نموني جي معيار جو هڪ بهتر اشارو آهي.FFPE پاران نڪتل آر اين اي لاءِ، ان ۾ جينز جي تعداد سان تمام گھڻو لاڳاپو آھي، جن کي مؤثر طريقي سان ڳولي سگھجي ٿو ۽ جينز جي تنوع [3].جيتوڻيڪ DV200 FFPE جي معيار جي چڪاس ۾ گھٽتائي کي پورو ڪري سگھي ٿو، Agilent bioanalyzer اڃا تائين RNA نموني ۾ معيار جي مسئلن جو جامع تجزيو نٿو ڪري سگھي، بشمول نمونن ۾ رڪاوٽون موجود آھن.Inhibitors پاڻ کي اثر انداز ڪري سگهن ٿا amplification ڪارڪردگيءَ جي هيٺئين دڙي جي تجربن کي ۽ گھٽائي سگھي ٿو مفيد ڊيٽا جي مقدار کي.معلوم ڪرڻ لاءِ ته ڇا نموني ۾ ڪو رڪاوٽ موجود آهي، اسان اڳتي بيان ڪيل حقيقي وقت فلورسنٽ مقداري PCR طريقو اختيار ڪري سگهون ٿا.

04 حقيقي وقت فلورسنٽ مقداري پي سي آر

حقيقي وقت فلورسنٽ مقداري پي سي آر جو طريقو نه رڳو نموني ۾ روڪيندڙن کي ڳولي سگھي ٿو، پر FFPE نموني ۾ آر اين اي جي معيار کي پڻ صحيح طور تي ظاهر ڪري ٿو.Agilent حياتياتي تجزين جي مقابلي ۾، حقيقي وقت فلوروسينس مقداري اوزار وڏين حياتياتي ليبارٽريز ۾ انهن جي وسيع ايپليڪيشن جي ڪري وڌيڪ مشهور آهن.آر اين اي نموني جي معيار کي جانچڻ لاءِ، اسان کي صرف اندروني حوالن جين لاءِ پرائمر پروبس خريد ڪرڻ يا تيار ڪرڻ گهرجن، جهڙوڪ GUSB (Cat no. Hs00939627).پرائمر، پروبس ۽ معيارن جي هن سيٽ کي استعمال ڪندي (ڄاڻايل ڪنسنٽريشن جو ڪل RNA) مطلق مقداري تجربا ڪرڻ لاءِ، مؤثر آر اين اي فريگمينٽ ڪنسنٽريشن جو اندازو لڳائي سگهجي ٿو آر اين اي معيار جي تشخيصي معيار (مختصر لاءِ فنڪشنل آر اين اي ڪوانٽيٽيشن (FRQ)).هڪ NGS ٽيسٽ ۾، اسان ڏٺو ته آر اين اي نموني جي FRQ جو مؤثر ڊيٽا جي مقدار سان تمام گهڻو تعلق آهي.سڀني نمونن لاءِ 0.2ng/uL FRQ کان وڌيڪ، گهٽ ۾ گهٽ 70٪ ريڊز مؤثر طريقي سان ريفرنس جي ترتيب کي ڍڪي سگهن ٿا (شڪل 4).

شڪل 4، فلوروسينس مقدار جي طريقي سان معلوم ڪيل FRQ قدر جو NGS تجربن ۾ حاصل ڪيل موثر ڊيٽا سان تمام گھڻو تعلق (R2>0.9) آھي.ڳاڙهو لڪير FRQ قدر 0.2 ng/uL جي برابر آهي (log10 = -0.7).【4】

FFPE نموني تي لاڳو ٿيڻ کان علاوه، حقيقي وقت جي مقدار جي پي سي آر جو طريقو پڻ نموني ۾ روڪڻ وارن کي مؤثر طور تي مانيٽر ڪري سگھي ٿو.اسان نموني شامل ڪري سگھون ٿا ردعمل سسٽم ۾ داخل ٿيڻ واري مثبت ڪنٽرول (IPC) ۽ ان جي Assay سان، ۽ پوء Ct قدر حاصل ڪرڻ لاء فلورسنس مقدار جي عمل کي انجام ڏيو.جيڪڏهن Ct قدر Ct قدر جي پويان بغير نموني جي رد عمل ۾ رهي ٿي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته موڙيندڙ نموني ۾ موجود آهي ۽ رد عمل ۾ وڌائڻ واري ڪارڪردگي کي روڪي ٿو.

05 ڪوبٽ فلورسنٽ رنگ جو طريقو

Qubit Fluorometer سڀ کان عام طور تي استعمال ٿيل ننڍڙو ڊيوائس آهي جيڪو نيوڪليڪ ايسڊ ڪنسنٽريشن ۽ پاڪائي معلوم ڪرڻ لاءِ آهي، جيڪو هلائڻ آسان آهي ۽ لڳ ڀڳ هر ماليڪيولر بائيولاجي ليبارٽري ۾ موجود آهي.اهو درست طريقي سان حساب ڪري ٿو نيوڪلڪ ايسڊ جي ڪنسنٽريشن کي ڳولڻ ۽ نيوڪليڪ ايسڊ بائنڊنگ فلورسنٽ ڊائي (Qubit detection reagent).Qubit ۾ اعلي حساسيت ۽ خاصيت آهي، ۽ صحيح طور تي RNA کي pg/µL ڪنسنٽريشن تائين گھٽائي سگھي ٿو.نيوڪليڪ ايسڊ ڪنسنٽريشن کي درست انداز ۾ اندازو ڪرڻ جي سڃاتل صلاحيت کان علاوه، Thermo Fisher جو تازو نئون ماڊل Qubit 4.0 پڻ RNA جي سالميت کي ڳولي سگھي ٿو.Qubit 4.0′s RNA detection system (RNA IQ Assay) آر اين اي جي سالميت کي سڃاڻي ٿو هڪ ئي وقت ٻن مخصوص فلورسنٽ رنگن کي ڳولڻ سان.اهي ٻه فلورسنٽ رنگ، ترتيب سان آر اين اي جي وڏن ٽڪرن ۽ ننڍن ٽڪرن سان ڳنڍيل هوندا.اهي ٻه فلورسنٽ رنگ نموني ۾ آر اين اي جي وڏن ٽڪرن جي تناسب کي ظاهر ڪن ٿا، ۽ ان مان IQ (انٽيگرٽي ۽ ڪيفيت) جو اندازو لڳائي سگهجي ٿو جيڪو آر اين اي جي معيار جي نمائندگي ڪري ٿو.IQ قدر ٻنهي FFPE ۽ غير FFPE نموني تي لاڳو ٿئي ٿو، ۽ بعد ۾ ترتيب ڏيڻ واري معيار تي وڏو اثر آهي.NGS تجربن کي مثال طور وٺي، Ion torrent™ پليٽ فارم تي ڪيل RNA-Seq ٽيسٽ تجربن ۾، 4 کان وڌيڪ IQ قدرن سان گڏ گھڻا نمونا گھٽ ۾ گھٽ 50٪ اثرائتي پڙھندا ھئا (شڪل 5).مٿي ڄاڻايل طريقن جي ڳولا جي طريقن جي مقابلي ۾، Qubit IQ Assay نه رڳو ڪم ڪرڻ ۾ وڌيڪ آسان آهي ۽ گهٽ وقت وٺندو آهي (پنجن منٽن اندر)، پر ماپيل پيراميٽر IQ قدر ۽ هيٺاهين تجربن جي ڊيٽا جي معيار جي وچ ۾ پڻ وڏو تعلق آهي.

شڪل 5، ڪوبٽ RNA IQ قدر ۽ RNA-Seq جي نقشي ۾ ٺهيل ريڊز جي وچ ۾ وڏو تعلق آهي.【5】

مٿي ڏنل تعارف ذريعي، مان سمجهان ٿو ته هر ڪنهن کي مختلف آر اين اي معيار جي ڪنٽرول طريقن جي ڪافي ڄاڻ آهي.عملي طور تي، توهان چونڊي سگهو ٿانموني جي قسم ۽ موجوده آلات جي مطابق لاڳاپيل طريقو.صرف آر اين اي جي معيار کي چڱيءَ طرح سنڀالڻ سان ئي اسين ايندڙ تجربن جي ناڪاميءَ کان بچي سگهون ٿا، جنهن سبب پيدا ٿيندڙ نمونن جي خراب معيار جي ڪري قيمتي وقت، توانائي ۽ خرچ بچائي سگهون ٿا.

حوالو مصنوعات:

جانورن جي ڪل آر اين اي آئسوليشن کٽ

Cell Total RNA Isolation Kit

حوالا

【1】 شروڊر، اي.، مولر، او.، اسٽاڪر، ايس وغيره.RIN: هڪ RNA سالميت نمبر آر اين اي ماپن کي سالميت جي قيمتن کي تفويض ڪرڻ لاءِ.BMC Molecular Biol 7، 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 آنڪائن انساني مدافعتي ريپرٽويئر يوزر گائيڊ (پب نمبر MAN0017438 Rev. C.0).

【3】ليه سي ويهمس، چارلس اي ووڊ، برائن اين چورلي، ڪيرول ايل يوڪ، گيل ايم نيلسن، سوسن ڊي هيسٽر، آرڪيول فارملين-فڪسڊ پيرافين-ايمبيڊڊ ٽشوز جا نمونا، وولومولوجيڪل سائنسز، پيج 201، وولومولوجيڪل سائنسز، صفحو 201، آر اين اي جو جائزو وٺڻ لاءِ وڌايل معيار جا معيار. 357-373https://doi.org/10.1093/toxsci/