اسان کي تجربيڪار ڪاريگر ڪيو ويو آهي.وڏي رعايت واري چين جي اعليٰ حساسيت هڪ قدم جي جاچ Rt- لاءِ پنهنجي مارڪيٽ جي اهم سرٽيفڪيٽن ۾ اڪثريت حاصل ڪرڻ.QpcrKit V2، معيار ڪارخاني جي زندگي آهي، گراهڪ جي مطالبي تي ڌيان ڏيڻ ڪمپني جي بقا ۽ ترقي جو ذريعو آهي، اسان ايمانداري ۽ نيڪ نيتي سان ڪم ڪندڙ رويا تي عمل ڪريون ٿا، توهان جي اچڻ جا منتظر آهيون!
اسان کي تجربيڪار ڪاريگر ڪيو ويو آهي.ان جي مارڪيٽ جي اهم سرٽيفڪيشن ۾ اڪثريت حاصل ڪرڻ لاءچين تاڪ ڊي اين اي پوليمريس, Qpcr، اسان جي ڪمپني واعدو ڪيو: مناسب قيمتون، مختصر پيداوار جو وقت ۽ اطمينان بخش بعد ۾ سيلز سروس، اسان توهان کي ڀليڪار ڪيون ٿا ته اسان جي ڪارخاني جو دورو ڪريو ڪنهن به وقت توهان چاهيو ٿا.ڪاش هاڻي اسان وٽ هڪ خوشگوار ۽ ڊگهي اصطلاحن جو ڪاروبار گڏ هجي !!!

وضاحتون

هي ڪٽ هڪ منفرد ليسس بفر سسٽم استعمال ڪري ٿو جيڪو جلدي آر اين اي کي ڪلچر ٿيل سيلن جي نمونن مان RT-qPCR رد عملن لاءِ آزاد ڪري سگهي ٿو، ان ڪري وقت سازي ۽ محنتي RNA صاف ڪرڻ واري عمل کي ختم ڪري ٿو.آر اين اي ٽيمپليٽ صرف 7 منٽن ۾ حاصل ڪري سگھجي ٿو.کٽ پاران مهيا ڪيل 5×Direct RT Mix ۽ 2×Direct qPCR Mix-SYBR ريجنٽس جلدي ۽ مؤثر طريقي سان حقيقي وقت جي مقداري PCR نتيجا حاصل ڪري سگھن ٿا.

5×Direct RT Mix ۽ 2×Direct qPCR Mix-SYBR وٽ مضبوط روڪيندڙ رواداري آهي، ۽ نموني جي lysate کي RT-qPCR لاءِ ٽيمپليٽ طور استعمال ڪري سگهجي ٿو.ھن کٽ ۾ منفرد RNA ھاءِ affinity Foregene reverse transcriptase، ۽ Hot D-Taq DNA پوليمريز، dNTPs، MgCl شامل آھن.₂، ردعمل بفر، پي سي آر آپٽمائزر ۽ اسٽيبلائيزر.

وضاحتون

200×20μl Rxns، 1000×20μl Rxns

کٽ جا اجزاء

خاصيتون ۽ فائدا

■ سادو ۽ اثرائتو: Cell Direct RT ٽيڪنالاجي سان، RNA جا نمونا صرف 7 منٽن ۾ حاصل ڪري سگھجن ٿا.

■ نموني جو مطالبو ننڍڙو آهي، جيئن گهٽ ۾ گهٽ 10 سيلز کي آزمائي سگهجي ٿو.

■ هاءِ ٿرو پُٽ: اهو 384، 96، 24، 12، 6-ويل پليٽس ۾ ڪلچر ٿيل سيلز ۾ آر اين اي کي جلدي ڳولي سگهي ٿو.

■ ڊي اين اي ريزر جلدي جاري ڪيل جينوم کي هٽائي سگھي ٿو، بعد ۾ ايندڙ تجرباتي نتيجن تي اثر گھٽائي سگھي ٿو.

■ آپٽمائزڊ RT ۽ qPCR سسٽم ٻن قدمن واري RT-PCR ريورس ٽرانسڪرپشن کي وڌيڪ ڪارائتو ۽ PCR وڌيڪ مخصوص، ۽ RT-qPCR رد عمل جي روڪٿام کي وڌيڪ مزاحمتي بڻائي ٿو.

ڪٽ ايپليڪيشن

ايپليڪيشن جو دائرو: ثقافتي سيلز.

- آر اين اي نموني ليسس پاران جاري ڪيو ويو: صرف هن کٽ جي RT-qPCR ٽيمپليٽ تي لاڳو ٿئي ٿو.

- ڪٽ ھيٺين مقصدن لاءِ استعمال ٿي سگھي ٿو: جين جي اظهار جو تجزيو، siRNA-ثالث جين سائلننگ اثر جي تصديق، دوا جي اسڪريننگ وغيره.

خاڪو

اسٽوريج ۽ شيلف زندگي

هن کٽ جو حصو I 4 ℃ تي ذخيرو ڪيو وڃي.حصو II -20 ℃ تي ذخيرو ڪيو وڃي.

Foregene Protease Plus II کي 4 ℃ تي ذخيرو ڪيو وڃي، منجمد نه ڪريو -20 ℃ تي.

ريجنٽ 2×Direct qPCR Mix-SYBR اوندهه ۾ -20℃ تي ذخيرو ٿيڻ گهرجي؛جيڪڏهن اڪثر استعمال ڪيو وڃي، اهو پڻ محفوظ ڪري سگهجي ٿو 4℃ تي مختصر مدت جي اسٽوريج لاءِ (استعمال 10 ڏينهن اندر).Wining the majority of the crucial certifications of its market for Big discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2 , معيار ڪارخاني جي زندگي آهي , گراهڪن جي طلب تي ڌيان ڏيڻ جو ذريعو ڪمپني جي بقا ۽ ترقي لاءِ آهي , We adhere to honesty and good faith working attitude, looking forward to your comes!
وڏي رعايتچين تاڪ ڊي اين اي پوليمريس، Qpcr، اسان جي ڪمپني واعدو ڪيو: مناسب قيمتون، مختصر پيداوار جو وقت ۽ اطمينان بخش بعد ۾ سيلز سروس، اسان پڻ توهان کي ڀليڪار ڪيون ٿا ته اسان جي ڪارخاني جو دورو ڪريو ڪنهن به وقت توهان چاهيو ٿا.ڪاش هاڻي اسان وٽ هڪ خوشگوار ۽ ڊگهي اصطلاحن جو ڪاروبار گڏ هجي !!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qپي سي آر Kit -طاقan

Cat.No.DRT-01021/01022

سيل لاءِ سڌو RT-qPCR استعمال ڪندي ≤ 1000,000 سيلز

پيداوار جو تعارف

هي پراڊڪٽ RT-qPCR رد عمل لاءِ ڪلچر ٿيل سيلن جي نمونن مان آر اين اي کي جلدي ڇڏڻ لاءِ هڪ منفرد ليسس بفر سسٽم استعمال ڪري ٿو، وقت سازي ۽ محنت طلب آر اين اي صاف ڪرڻ واري عمل کي ختم ڪري ٿو، ۽ گهربل آر اين اي ٽيمپليٽ حاصل ڪرڻ لاءِ صرف 7 منٽ، 5× Direct RT Mix، 2× Direct qPCR Mix-Tacientant by Real-Tacientant by 2× Direct qPCR Mix-Tacientant by the Real Time. نتيجا.

5× Direct RT Mix ۽ 2× Direct qPCR Mix-Taqman وٽ مضبوط روڪٿام رواداري آهي ۽ نموني جي lysate کي استعمال ڪندي موثر ريورسل ۽ مخصوص ايمپليفڪيشن انجام ڏئي سگھن ٿا ٽيمپليٽ جي طور تي ماپڻ لاءِ.ريجنٽ ۾ Foregene Reverse Transcriptase، Hot D-Taq DNA Polymerase، dNTPs، MgCl شامل آهن.₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer ۽ Stabilizer، جيڪو lysis بفر سان استعمال ڪري سگھجي ٿو جلدي ۽ آساني سان نموني کي معلوم ڪرڻ لاءِ، ۽ ان ۾ اعليٰ حساسيت، خاصيت ۽ استحڪام جون خاصيتون آھن.

پيداوار جون خاصيتون

سادي، مؤثر سيل سڌو RT ٽيڪنالاجي جيڪا RNA نموني حاصل ڪرڻ لاءِ 7 منٽ کان گهٽ لڳندي آهي.

نموني گهرجون ننڍا آهن، ۽ گهٽ ۾ گهٽ 10 ڪلچر ٿيل سيلز استعمال ڪري سگهجن ٿيون.

تيز رفتار آر اين اي جي حاصلات لاءِ اعليٰ طريقه ڪار ڪلچر ٿيل سيلز جهڙوڪ 384، 96، 24، 12، ۽ 6-ويل پليٽس.

ڊي اين اي ريزر جلدي جاري ڪيل جينوم کي ختم ڪرڻ جي قابل آهي، بعد ۾ تجرباتي نتيجن تي اثر کي گھٽائي ٿو.

آپٽمائزڊ RT ۽ qPCR سسٽم ٻه-قدم RT-PCR کي وڌيڪ موثر ريورس ٽرانسپشن، خاصيت، ۽ مضبوط RT-qPCR رد عمل جي روڪٿام رواداري سان فعال ڪن ٿا.

ڪٽ ايپليڪيشن

درخواست جو دائرو: ثقافتي سيل.

نموني ليسس جو تعبير ڪيو ويو آر اين اي: استعمال ڪيو ويو صرف ٻه قدم RT-qPCR ٽيمپليٽ جي طور تي.

ڪٽس هيٺين مقصدن لاءِ استعمال ڪري سگھجن ٿيون: جيني ريگيوليٽري ايڪسپريس جو تجزيو، ايللي ٽيسٽنگ، ڊرگ اسڪريننگ وغيره.

ڪيٽ جون حدون

وڌايل ٽڪرا ≤ 300 bp.

ڪٽس تازي ڪلچر سيلز لاء استعمال ڪيا ويا آهن.

پيداوار جي معيار ڪنٽرول

FOREGENE جي ٽوٽل ڪوالٽي مئنيجمينٽ سسٽم جي مطابق، Cell Direct RT-qPCR سيريز کٽ جي هر بيچ کي ڪيترائي ڀيرا سختي سان آزمايو ويو آهي ته جيئن ڪٽس جي هر بيچ جي معيار جي اعتبار ۽ استحڪام کي يقيني بڻائي سگهجي.

کٽ جو مواد

*:سيل ليسس، 5×Direct RT Mix، 2× Direct qPCR Mix-Taqman الڳ الڳ خريد ڪري سگھجي ٿو، تفصيل ضميمو 1 (صفحو 13) ۾ ڏنل آهن.

اسٽوريج حالتون

1. شپنگ حالتون

گھٽ درجه حرارت جي آئس پيڪ باڪس جي نقل و حمل جو سڄو عمل، انهي کي يقيني بڻائڻ ته ڪٽ <4 ° C جي حالت ۾ آهي.

2. اسٽوريج حالتون

حصو I کي 4 ° C تي ۽ حصو II -20 ° C تي ذخيرو ڪريو.

Foregene Protease Plus II کي 4 ° C تي ذخيرو ڪرڻ گهرجي، منجمد نه -20 ° C تي.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman -20°C تي ذخيرو ٿيل آهي، يا 4°C تي مختصر مدت جي استعمال لاءِ جيڪڏهن بار بار استعمال ڪيو وڃي (10 ڏينهن اندر).

کٽ جي اجزاء جي ڄاڻ

بفر CL: سيل ليسس ردعمل لاء گهربل ماحول فراهم ڪري ٿو.

Buffer ST: بعد ۾ RT تي اثرات کان بچڻ لاء lysate ۾ فعال مادي کي ختم ڪري ٿو.

ڊي اين اي ريزر: ڊي اين اي ريموور، ايندڙ تجربن تي جينوم کي هٽائڻ جو اثر.

5× Direct RT Mix: اعليٰ آر اين اي لاڳاپن تي مشتمل آهي Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilizers, enhancers, optimizers, and reverse transscription primers for optimal alignment (Random Primer, Oligo(dT)₁₈پرائمر).

Foregene Protease Plus II: lysis buffer جي حوالي سان، سيلز نيوڪليڪ اسيد ڇڏڻ لاءِ ليز ڪيا ويندا آهن.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: هي ريجينٽ گرم D-Taq DNA Polymerase، dNTPs، MgCl تي مشتمل آهي₂، ردعمل بفر، پي سي آر آپٽمائزر، ۽ اسٽيبلائيزر.

20 × ROX ريفرنس ڊائي: عام طور تي ABI، Stratagene ۽ ٻين ڪمپنين جي ريئل ٽائيم پي سي آر ايمپليفڪيشن آلات تي استعمال ڪيو ويندو آهي، اهو استعمال ڪيو ويندو آهي پي سي آر ٽيوب ۽ ٽيوب جي وچ ۾ فرق کي ترتيب ڏيڻ لاءِ پي سي آر ڊوزنگ غلطين جي ڪري.مختلف اوزارن لاءِ گهربل 20 × ROX ريفرنس ڊائي ڪنسنٽريشن مختلف آهي، ۽ صارف ان کي اوزار جي تجويز ڪيل ڪنسنٽريشن جي مطابق شامل ڪري سگھي ٿو.

RNase-مفت ddH₂O: RNase-free sterilized الٽرا خالص پاڻي ٻن قدمن لاءِ RT-qPCR رد عمل.

اپاءُ:(ڪيٽ استعمال ڪرڻ کان پهريان احتياطي تدبيرون احتياط سان پڙهو)

نموني جي وچ ۾ ڪراس آلودگي کان بچڻ لاءِ تجربي جي آپريشن جي طريقي تي ڌيان ڏيو.

RNase آلودگي ۽ آر اين اي جي تباهي کان بچڻ لاء تجرباتي ماحول ۽ برتن جي صفائي تي ڌيان ڏيو.

تازو يا چڱي طرح محفوظ ڪيل سيل جا نمونا وٺو ۽ بار بار منجمد ٿيل سيل جا نمونا استعمال نه ڪريو.

5× Direct qPCR Mix,2× Direct qPCR Mix- Taqman کي بار بار منجمد ٿيڻ کان پاسو ڪرڻ گهرجي، ٻي صورت ۾ اهو ريورس ٽرانسڪرپشن ۽ پي سي آر جي ڪارڪردگي کي متاثر ڪندو.

تياريراشناڳآپريشن

هن ڪٽ کي استعمال ڪرڻ کان اڳ احتياط سان هدايتون پڙهڻ جي پڪ ڪريو.Cell Direct RT-qPCR ڪٽ سادو، آسان ۽ هلائڻ لاءِ تيز آهي، ۽ هدايتون پوري ڪٽ بابت مڪمل معلومات مهيا ڪن ٿيون ۽ ان کي ڪيئن استعمال ڪجي.مھرباني ڪري استعمال ڪرڻ کان اڳ ضروري تجرباتي مواد ۽ سامان تيار ڪريو.

تجرباتي مواد ۽ سامان

◆ ڪلچر سيل.

◆ 1.5 ml يا 2 ml، RNase-/DNase-Free centrifuge tube، RNase-/DNase-Free ٽپ، 0.2 ml sterile qPCR ٽيوب.

◆ qPCR مشين، پائيپٽ، ٽيبل ٽاپ سينٽريفيوج (≥13,400×g) (تجرباتي ضرورتن تي مدار رکندي) وغيره.

حفاظت

◆ ھي پراڊڪٽ صرف سائنسي تحقيق جي مقصدن لاءِ آھي، مھرباني ڪري ان کي دواسازي، ڪلينڪل، کاڌي ۽ کاسمیٹڪ مقصدن لاءِ استعمال نه ڪريو.

◆ ڪيميائي استعمال ڪرڻ وقت، مناسب ليبارٽري ڪپڙا، دستانا، حفاظتي چشما وغيره پائڻ.

آپريشنھدايتون

سيل ليسس سسٽم، آر ٽي سسٽم، ۽ qPCR ردعمل حل ضمني پيڪ الڳ الڳ خريد ڪري سگھجن ٿا، تفصيل لاء ضميمه 1 (صفحو 13).

آپريشن گائيڊ

ج: آر اين اي ڇڏڻ جو نمونو

1. سيلز اڳ ۾ تيار ڪيا ويا: سيل ڪلچر پليٽ کي ٿڌو PBS سان ڌوء، پوء سيلز کي لڪايو (10-10⁶)، 10⁶ سيلز جي مقدار جي ڀيٽ ۾، سفارش ڪئي وئي آهي Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) يا Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) RNA ڪڍڻ ۽ صاف ڪرڻ لاءِ.

1.1.Adherent سيلز (24- مثال طور پليٽ پليٽ)

1.1.1.هر کوهه ۾ سيلن جي تعداد جو اندازو لڳايو، اندازو لڳايو ته سيلن جو تعداد 1 × 10 آهي⁵، ۽ ڪلچر ڊش مان ڪلچر وچولي کي هٽائڻ لاءِ پائپٽ استعمال ڪريو.

1.1.2.هر کوهه ۾ 200 μl اڳي ٿڌي 1 × PBS شامل ڪريو.بار بار پائپ نه ڪريو ۽ PBS کي کوهن مان هٽايو.پليٽ کي ڇڪيو ۽ جيترو ٿي سگھي PBS کي هٽايو.قدم 2 ڏانھن اڳتي.

1.1.3.سيل ڪلچر ڊش ۾ مختلف سيل ڪلچر ڊش يا ريفرنس نمبر ٽيبل 1-1 سيل ڪلچر ڊش ۾ شامل ڪيو ويو اڳي کوليو 1 × PBS سيل ڌوئڻ لاءِ.

ٽيبل 1-1: سيلز جي مختلف انگن لاء PBS dosage

نوٽ:پڪ ڪرڻ لاء هڪ مضبوط پابند سيلز،ڌوئڻ دوران سيل جي نقصان جو هڪ وڏو تعداد بچايو ويو.

1.2.معطل ٿيل سيلز يا پيروي ڪندڙ سيلز جيڪي غير پورس پليٽن ۾ ڪلچر ٿيل آهن

1.2.1.غير ملٽي ويل پليٽس ۾ ڪلچر ٿيل اڊرينٽ سيلز (سسپينشن سيلز ايندڙ قدم 1.2.2 کان شروع ٿين ٿا)، سيلز کي گڏ ڪريو ۽ الڳ ڪريو عام سيل ڪليڪشن جي طريقي موجب، ۽ انھن کي ڪلچر پليٽ يا سينٽريفيوج ٽيوب ۾ رکو؛جيڪڏهن ٽريپسينائيزيشن استعمال ٿئي ٿي، سيلز کي گڏ ڪرڻ لاءِ سينٽرفيوگريشن جي ضرورت آهي ۽ باقي بچيل ٽريپسن کي هٽائڻ لاءِ، سيلز کي منتشر ڪرڻ لاءِ انفرادي سيلز ۾ PBS ٻيهر بحال ٿيل سيلز شامل ڪيو ويو آهي.

1.2.2.سيلز جي ڳڻپ کان پوء، aliquoted سيلز 1 × 10⁵ هڪ کان سينٽرفيوج ٽيوب تائين، 10 منٽ لاءِ 1000 × g تي سينٽريفيوگيشن ذريعي سيلز گڏ ڪريو.

1.2.3.سينٽرفيوج ٽيوب ۾ 200 μl PBS شامل ڪريو، بار بار پائپ نه ڪريو، ۽ PBS کي سڌو سنئون.قدم 2 ڏانھن اڳتي وڌو. (جيڪڏھن تيز ٿيڻ ڏکيو آھي ۽ سيلز کي ٻيهر بحال ڪيو ويو آھي، ٿي سگھي ٿو 1000×g centrifuged 10 منٽ کان پوءِ سپرنٽنٽ کي رد ڪرڻ کان پوءِ، سيل پيلٽ قدم 2 ڏانھن اڳتي وڌو)

2.Cell lysis: Buffer CL کي هٽايو، ان جو گرمي پد ڪمري جي درجه حرارت تي برابر ڪيو ويو، DNA Eraser ۽ Foregene Protease Plus II، هيٺ ڏنل جدول 1-2 تيار ڪيل ليسس سسٽم مطابق: (ليسس حل استعمال لاءِ تيار آهي).

جدول 1-2: ڦاٽڻ سسٽم جي تياري (نوٽ: برف تي تياري ۾)

3. (مثال طور 24-ويل پليٽ) پائپٽ 200 μl سيل ليسس ماسٽر هر کوهه ۾ ملائي، بار بار 5-10 ڀيرا ڦوڪيو، ڪمري جي گرمي پد (20-25 ℃) تي 5 منٽ لاء.

نوٽ:بلبل جي ٺهڻ کان بچڻ لاء، مهرباني ڪري جڏهن pipetting pipette پيماني تي 200μl يا گهٽ ۾ ترتيب ڏني وئي هئي.سيلز lysis کان پوء بادل ظاهر ٿي سگھي ٿو، جيڪو عام آهي.

4. (مثال طور 24-ويل پليٽ) مائع 20 μl بفر ايس ٽي ۾ شامل ڪيو ويو آهي (مختلف ليسس سسٽم بفر ايس ٽي ٽيبل 1-3 ۾ ڏيکاريل رقم ۾ شامل ڪيا ويا آهن)، پائپنگ کي 5-10 ڀيرا ورجايو ويو، ڪمري جي حرارت تي (20-25 ℃) 2 منٽ لاء انڪيوبيٽ ڪيو ويو.

نوٽ:پائپٽ ٽپ کي مٿاڇري کان هيٺ ڪڍيو ويو، انهي کي يقيني بڻائي ته ليسٽ شامل ڪيو ويو،بلبلن جي ٺهڻ کان بچڻ لاء، مهرباني ڪري جڏهن پائپنگ پائپٽ اسڪيل کي 200μl يا گهٽ ۾ ترتيب ڏني وئي هئي.

ٽيبل 1-3:بفر ايس ٽي شامل ڪريو

5.The lysate بعد ۾ RT-qPCR تجربن لاء استعمال ڪيو ويندو آهي.جيڪڏهن ايندڙ تجربا وقت ۾ نه ٿي سگهن، مهرباني ڪري ان کي برف تي 2 ڪلاڪ کان وڌيڪ نه رکو، ۽ ذخيرو ڪريو -20 ℃ يا -80 ℃ (ٽن مهينن کان وڌيڪ نه).

ب: آر ٽي سسٽم جي تياري

1. 5 × Direct RT Mix ڪڍو ۽ ان کي آئس باٿ تي رکو، ان کي قدرتي طور پگھلڻ ڏيو، ۽ بعد ۾ استعمال لاءِ آسانيءَ سان ملايو؛RNase-Free ddH2O ڪڍو ۽ ان کي ڳريو ۽ بعد ۾ استعمال لاءِ آئس باٿ تي رکو.هيٺ ڏنل جدول 2-1 جي مطابق برف تي ردعمل سسٽم تيار ڪريو.

ٽيبل 2-1: RT ردعمل سسٽم جي تياري

2. سسٽم ٺاھڻ جي مڪمل ٿيڻ کان پوء، ھيٺ ڏنل جدول 2 -2 رد عمل جي حالتن ۾ RT رد عمل کي نرمي سان ملايو ۽ سينٽرفيوجڊ مختصر طور تي.

ٽيبل 2-2: RT رد عمل جي حالت سيٽنگ

3. رد عمل جي مڪمل ٿيڻ کان پوء، رد عمل جي پيداوار سڌو سنئون برف تي رکيل هئي qPCR لاء، مهرباني ڪري ڊگھي مدت جي بچاء رکو -20 ℃ يا -80 ℃.

نوٽ: غير صاف ٿيل ٽيمپليٽ جي استعمال جي ڪري، ريورس ٽرانسڪرپشن پراڊڪٽ ۾ اڇا ٽڪڙا ظاهر ٿي سگھن ٿا.هي هڪ معمولي رجحان آهي.ايندڙ تجربن لاءِ فوري طور تي سپرنيٽنٽ کي سينٽرفيوج ڪريو.

نتيجي ۾ RT رد عمل جو حل ايندڙ قدم ۾ شامل ڪيو ويو آهي ريئل ٽائيم پي سي آر رد عمل سسٽم، ان کي شامل ڪرڻ جي سفارش ڪئي وئي آهي 10-30٪ رد عمل سسٽم جي حد تائين.

ج: qPCR ردعمل سسٽم جي تياري

1. رد عمل سسٽم تيار ڪرڻ لاءِ هيٺين جدول 3-1 جي مطابق قدم cDNA ٽيمپليٽ ۾ تيار ڪيل B جي مناسب مقدار.

نوٽ: cDNA ٽيمپليٽ جي رقم qPCR سسٽم جي 10-30٪ جي حساب سان.مثال طور، 20μl qPCR سسٽم ۾، 2-6 μl lysis بفر شامل ڪريو، پر 6 μl کان وڌيڪ نه.

2. qPCR رد عمل لاءِ بهتر qPCR حالتون (Annealing temperature ， etc.) (جي رد عمل جون حالتون ٽيبل 3-2 تي ڏنل آهن).

نوٽ: بهتر نتيجا حاصل ڪرڻ لاءِ qPCR رد عمل لاءِ بهتر حالتون استعمال ڪرڻ جي ڪوشش ڪريو.

ٽيبل 3-1: پي سي آر ردعمل سسٽم جي تياري

1.

نوٽ: qPCR سسٽم تجرباتي ضرورتن ۽ فلورسنس سائيڪلر ماڊل جي مطابق ترتيب ڏئي سگهجي ٿو.50 ۾ qPCR لاءِμl سسٽم، 20 جي مطابق تناسب سان ريگينٽ دوز کي ترتيب ڏيوμايل سسٽم.

2*: ROX ريفرنس ڊائي جي مناسب حتمي ڪنسنٽريشن کي منتخب ڪريو فلوروسينس مقداري حرارتي سائيڪل جي مطابق.عام fluorescence quantitative cyclers لاء سڀ کان وڌيڪ مناسب ROX ريفرنس ڊائي ڪنسنٽريشن هيٺ ڏنل جدول ۾ ڏيکاريل آهن:

جدول 3-2: qPCR رد عمل جون حالتون مهيا ڪيون ويون آهن

نوٽ: بهترين qPCR اثر حاصل ڪرڻ لاءِ، مختلف ٽيمپليٽس ۽ مختلف پرائمر لاءِ رد عمل جي حالتن کي بهتر ڪرڻ لاءِ گريڊينٽ پي سي آر استعمال ڪري سگھجي ٿو.PCR رد عمل جون حالتون مختلف هونديون آهن فلورسنس اينالائزر، ٽيمپليٽ، پرائمر وغيره جي لحاظ کان. مخصوص آپريشن ۾، بهترين رد عمل جون حالتون فلورسنس مقداري حرارتي سائيلر جي مخصوص حالتن جي مطابق ٺهڻ گهرجن، ٽيمپليٽ جو قسم، دلچسپيءَ جي ٽڪري جي ماپ، بنيادي ترتيب جي ترتيب، ايمپليفائيڊ ۽ پرائمر جي مواد جي ڊيگھ، ريڪشن جي وقت ۽ درجه حرارت جي ڊيگھ وغيره.

حقيقي وقت پي سي آر پرائمر ڊيزائن جا اصول

فارورڊ پرائمر ۽ ريورس پرائمر

حقيقي وقت پي سي آر لاء، پرائمر ڊيزائن تمام ضروري آهي.پرائمر PCR amplification جي خاصيت ۽ ڪارڪردگي سان لاڳاپيل آهن، ۽ هيٺ ڏنل اصولن جي حوالي سان ٺهيل ٿي سگهن ٿا:

◆ پرائمر ڊگھائي: 18-30bp.

◆ جي سي مواد: 40-60٪.

◆ Tm قدر: پرائمر ڊيزائن سافٽ ويئر، جهڙوڪ پرائمر 5، پرائمر جي Tm قدر ڏئي سگھي ٿو.اپ اسٽريم ۽ لانڊ اسٽريم پرائمر جي Tm قدرن کي جيترو ٿي سگھي ويجھو ٿيڻ گھرجي.Tm حساب ڪتاب جو فارمولا پڻ استعمال ڪري سگھجي ٿو: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).جڏهن پي سي آر کي انجام ڏيو، 5 ° C جي پرائمر Tm قدر کان هيٺ درجه حرارت عام طور تي اينيلنگ جي درجه حرارت جي طور تي چونڊيو ويندو آهي (اينيلنگ جي درجه حرارت ۾ لاڳاپيل اضافو پي سي آر جي رد عمل جي خاصيت کي وڌائي سگھي ٿو).

◆ پرائمر ۽ پي سي آر پروڊڪٽس:

◆ ڊزائين پرائمر پي سي آر ايمپليفڪيشن پراڊڪٽ ڊگھائي ترجيحي طور تي 100-150bp آهي.

◆ ٽيمپليٽ جي ثانوي ڍانچي واري علائقي ۾ ڊزائين پرائمر کي ممڪن حد تائين بچڻ گهرجي.

◆ اپ اسٽريم ۽ ڊائون اسٽريم پرائمر جي 3′ سرن جي وچ ۾ 2 يا وڌيڪ مڪمل ڪندڙ بنيادن جي ٺهڻ کان پاسو ڪريو.

◆ پرائمر 3′ ٽرمينل بيس 3 اضافي لڳاتار G يا C سان موجود نه ٿو ٿي سگھي.

◆ پرائمر پاڻ کي مڪمل ڪندڙ ڍانچي نٿا رکي سگھن، ٻي صورت ۾ بال جي پنن جي جوڙجڪ ٺھي ويندي، جيڪا پي سي آر ايمپليفڪيشن کي متاثر ڪندي.

◆ ATCG کي پرائمر جي ترتيب ۾ جيترو ممڪن ٿي سگهي ورهايو وڃي، ۽ 3′ ٽرمينل بيس کي T کان بچڻ گهرجي.

ضميمو1:Cايل سڌوRT-qPCR کٽ جو جزوt اضافي پيڪيج

1. سيل ليسس حل