پائيپٽ ٽائپس ۽ اي پي ٽيوبز وغيره جي sterilization.

1. تيار ڪريو 0.1٪ (هڪ هزارون) DEPC (انتهائي زهريلو مادو) deionized پاڻي سان، ان کي احتياط سان استعمال ڪريو fume hood ۾، ۽ ان کي ذخيرو ڪريو 4°C تي روشني کان پري؛

DEPC پاڻي خالص پاڻي آهي جيڪو DEPC سان علاج ڪيو ويندو آهي ۽ اعلي درجه حرارت ۽ اعلي دٻاء سان جراثيم ڪيو ويندو آهي.RNase، DNase ۽ پروٽيناس کان آزاد ٿيڻ جي آزمائش ڪئي وئي.

2. پائيپٽ ٽپ ۽ اي پي ٽيوب کي 0.1٪ DEPC ۾ وجھو، ۽ پڪ ڪريو ته پائپٽ ٽپ ۽ EP ٽيوب 0.1٪ DEP سان ڀريل آھن.

3. روشنيءَ کان بچاءُ، اٿڻ ڏيو، رات جو (12-24h)

4. ٽپ ۽ اي پي ٽيوب تي مشتمل دٻي کي DEPC ۾ لڪائڻ جي ضرورت ناهي.DEPC پاڻي کي ٽپ يا EP ٽيوب ۾ تقريبا هٽائڻ کان پوء، ان کي پيڪ ڪريو ۽ ان کي لپايو.

5. 121 درجا سينس، 30 منٽ

6. 180 درجا سينس، سڪي ڪيترن ڪلاڪن لاء (گهٽ ۾ گهٽ 3 ڪلاڪ)

نوٽ: الف.DEPC کي سنڀالڻ وقت ليٽڪس دستانو ۽ ماسڪ پائڻ!b، يا بغير DEPC sterilization، 130 ℃، 90min autoclave (ڪيتريون ليبارٽريون اعلي درجه حرارت ٻه ڀيرا sterilization)

آر اين اي ڪڍڻ تي غور

ٽشو آر اين اي جي الڳ ٿيڻ جي ناڪامي جا ٻه اهم واقعا

آر اين اي جي تباهي ۽ ٽشوز ۾ ناپاڪي جا باقي بچيل،انحطاط جي حوالي سان، اچو ته پهرين ڏسون ته ڪلچر ٿيل سيلن مان نڪتل RNA آسانيءَ سان خراب ڇو نه ٿي ٿئي.موجوده آر اين اي ڪڍڻ واري ريجنٽ سڀني اجزاء تي مشتمل آهي جيڪي تيزيء سان RNase کي روڪيندا آهن.ڪلچر ٿيل سيلز ۾ lysate شامل ڪريو، ۽ صرف ان کي ملايو، سڀني سيلن کي مڪمل طور تي lysate سان ملايو وڃي ٿو، ۽ سيلز مڪمل طور تي lysate ٿي ويا آهن.سيلز جي lysed ٿيڻ کان پوء، lysate ۾ فعال اجزا فوري طور تي intracellular RNase کي روڪيندا آهن، تنهنڪري آر اين اي برقرار رهي ٿو.ان جو مطلب اهو آهي ته، ڇاڪاڻ ته ڪلچر ٿيل سيلز آساني سان ۽ مڪمل طور تي lysate سان رابطو ڪري رهيا آهن، انهن جي آر اين اي آسانيء سان خراب نه ٿيندي آهي؛ٻئي طرف، ٽشو ۾ موجود آر اين اي آسانيءَ سان خراب ٿي ويندي آهي ڇاڪاڻ ته ٽشو ۾ موجود سيلز ليسيٽ سان جلدي رابطو ڪرڻ آسان نه هوندا آهن.ڪافي رابطي جي ڪري.سو،فرض ڪيو ته آر اين اي جي سرگرمي کي روڪڻ دوران ٽشو کي هڪ سيل ۾ تبديل ڪرڻ جو هڪ طريقو آهي، تباهي جو مسئلو مڪمل طور تي حل ٿي سگهي ٿو.

مائع نائيروجن ملنگ سڀ کان وڌيڪ مؤثر طريقو آهي.بهرحال، مائع نائيروجن ملنگ جو طريقو تمام ڏکيو آهي، خاص طور تي جڏهن نموني جو تعداد وڏو آهي.هن ايندڙ بهترين شيء کي جنم ڏنو: homogenizer.جيhomogenizerطريقو ان سوال تي غور نٿو ڪري ته سيلز جي lysate سان رابطو ٿيڻ کان اڳ RNase سرگرمي کي ڪيئن روڪيو وڃي ٿو، بلڪه دعا ڪري ٿو ته ٽشوز جي خرابي جي شرح ان شرح کان تيز آهي جنهن تي intracellular RNase RN کي خراب ڪري ٿو.

برقي homogenizer جو اثر بهتر آهي،۽ گلاس homogenizer جو اثر خراب آهي، پر عام طور تي، homogenizer جو طريقو تباهي واري رجحان کي روڪي نٿو سگهي.تنهن ڪري، جيڪڏهن ڪڍڻ کي خراب ڪيو ويو آهي، اصل برقي هوموجنائزر کي مائع نائيروجن سان پيس ڪرڻ لاء استعمال ڪيو وڃي.اصل شيشي جي homogenizer کي تبديل ڪيو وڃي اليڪٽرڪ homogenizer يا سڌي طرح مائع نائٽروجن سان ملائي.مسئلو تقريبا 100٪ ممڪن آهي.حل ٿيڻ.

نجاست جي باقيات جو مسئلو جيڪو ايندڙ تجربن تي اثر انداز ٿئي ٿو، تنزل جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ متنوع سبب آهن، ۽ حل به ساڳيءَ ريت مختلف آهن.نتيجي ۾،جيڪڏهن ٽشو ۾ خرابي يا بقايا نجاست آهي، مخصوص تجرباتي مواد لاءِ ڪڍڻ جو طريقو/ريگينٽ بهتر ٿيڻ گهرجي.بهتر ڪرڻ لاءِ توهان کي پنهنجا قيمتي نمونا استعمال ڪرڻ جي ضرورت ناهي: توهان بازار مان ڪجهه ننڍڙا جانور خريد ڪري سگهو ٿا جهڙوڪ مڇي/چکن، آر اين اي ڪڍڻ لاءِ مواد جو لاڳاپيل حصو وٺو، ۽ ٻيو حصو پروٽين ڪڍڻ لاءِ - وات، پيٽ ۽ آنڊن سان پيس.

ڪڍيل آر اين اي جو ٽارگيٽ آر اين اي استعمال ڪيو ويندو آهي مختلف فالو اپ تجربن لاءِ، ۽ ان جي معيار جون گهرجون مختلف هونديون آهن.

cDNA لائبريري جي اڏاوت لاءِ آر اين اي سالميت جي ضرورت آهي بغير اينزيم ريڪڪشن انبيٽرز جي باقيات جي؛اتر کي اعلي آر اين اي سالميت جي ضرورت آهي ۽ اينزيم ردعمل جي رڪاوٽن جي رهائش لاء هيٺين گهرجن؛RT-PCR کي تمام اعلي آر اين اي سالميت جي ضرورت ناهي،پر اينزيم جي رد عمل کي روڪي ٿو.رهائش جون گهرجون سخت آهن.ان پٽ آئوٽ پٽ کي طئي ڪري ٿو؛هر ڀيري مقصد اهو آهي ته سڀ کان وڌيڪ خالص آر اين اي حاصل ڪرڻ، اهو ماڻهن ۽ پئسا خرچ ڪندو.

نمونن جو مجموعو/ ذخيرو

تباهي کي متاثر ڪندڙ عنصر نموني جي جاندار جسم/يا اصل واڌ ويجهه واري ماحول مان نڪرڻ کان پوءِ، نموني ۾ موجود Endogenous Enzymes RNA کي خراب ڪرڻ شروع ڪندا،۽ تباهي جي شرح endogenous enzymes ۽ درجه حرارت جي مواد سان لاڳاپيل آهي.روايتي طور تي، صرف ٻه طريقا آهن جن کي مڪمل طور تي ختم ڪرڻ واري اينزيم جي سرگرمي کي مڪمل طور تي روڪيو وڃي ٿو: فوري طور تي lysate شامل ڪريو ۽ چڱي طرح ۽ تيزيء سان هڪجهڙائي؛ننڍن ٽڪرن ۾ ڪٽ ڪريو ۽ فوري طور تي مائع نائٽروجن ۾ منجمد ڪريو.ٻنهي طريقن کي تيز آپريشن جي ضرورت آهي.پويون سڀني نمونن لاءِ موزون آهي، جڏهن ته اڳوڻو صرف انهن ٽشوز لاءِ موزون آهي جن ۾ سيلز ۽ انڊوجينس انزايمز جي گهٽ مواد ۽ هڪجهڙائي ڪرڻ آسان آهي.خاص طور تي، ٻوٽي جو بافتو، جگر، thymus، پينڪرياز، spleen، دماغ، ٿلهو، عضلات ٽشو، وغيره اڳتي وڌڻ کان اڳ مائع نائٽروجن سان بهترين طور تي منجمد آهن.

ورهاڱي ۽ نموني جي homogenization

تباهي ۽ پيداوار جي نموني کي ٽڪرائڻ تي اثر انداز ڪندڙ عنصرمڪمل homogenization لاء، جيڪو آر اين اي جي مڪمل ۽ مڪمل ڇڏڻ لاءِ آهي.سيلز کي ٽوڙڻ کان سواء سڌو سنئون ٿي سگهي ٿو.ٽشوز صرف ٽوڙڻ کان پوء هڪجهڙائي ڪري سگهجي ٿو.خمير ۽ بيڪٽيريا کي لاڳاپيل اينزائمز سان ٽوڙڻ جي ضرورت آهي ان کان اڳ ته اهي هڪجهڙائي ۾ هجن.ٽشوز جن ۾ هيٺين endogenous enzyme مواد ۽ آسان homogenization سان هڪ وقت ۾ هڪ homogenizer جي ذريعي lysate ۾ crushed ڪري سگهجي ٿو.ٻوٽي جو ٽشو، جگر، ٿامس، پينڪرياز، سپلين، دماغ، ٿلهو، عضلاتي ٽشو ۽ ٻيا نمونا، اهي يا ته اندريون اينزائمز ۾ وڏا هوندا آهن يا آساني سان هڪجهڙائي نه هوندا آهن،تنهنڪري بافتن جي ڀڃڪڙي ۽ هوموجنائيزيشن الڳ الڳ ٿيڻ گهرجي.تقسيم جو سڀ کان وڌيڪ قابل اعتماد ۽ سڀ کان وڌيڪ پيداوار طريقو مائع نائٽروجن سان ملنگ آهي، ۽ سڀ کان وڌيڪ قابل اعتماد طريقو هڪ برقي هوموجنائيزر جو استعمال آهي.مائع نائٽروجن سان ملنگ بابت هڪ خاص نوٽ: نموني کي پوري ملنگ جي عمل دوران نه پگھلايو وڃي، ڇاڪاڻ ته منجمد ٿيڻ دوران endogenous enzymes ڪم ڪرڻ جو وڌيڪ امڪان آهي.

lysate جو انتخاب

آپريشن جي سھولت تي اثر انداز ٿيڻ ۽ باقي رھندڙ اندروجينس ناپاڪيءَ جا عنصر عام طور تي استعمال ٿيل lysis حل RNase جي سرگرمي کي تقريباً روڪي سگھن ٿا.تنهن ڪري، هڪ lysis حل چونڊڻ جو اهم نقطو صاف ڪرڻ واري طريقي سان ميلاپ ۾ غور ڪرڻ آهي.ھڪڙو استثنا آھي:اعليٰ endogenous enzyme مواد سان گڏ نمونن لاءِ سفارش ڪئي وئي آهي ته فينول تي مشتمل lysate استعمال ڪن ته جيئن endogenous enzymes کي غير فعال ڪرڻ جي صلاحيت کي وڌايو وڃي.

صفائي جي طريقيڪار جو انتخاب

فيڪٽرز جيڪي متاثر ڪن ٿا رهجي ويل اندروجن نجاست، ڪڍڻ جي رفتار صاف نموني لاءِ جيئن سيلز، اطمينان بخش نتيجا حاصل ڪري سگهجن ٿا لڳ ڀڳ ڪنهن به صفائي واري طريقي سان هٿ ۾.پر ٻين ڪيترن ئي نمونن لاءِ، خاص طور تي جن ۾ نجاست جي اعليٰ سطحن جهڙوڪ ٻوٽن، جگر، بيڪٽيريا وغيره لاءِ، مناسب صاف ڪرڻ جو طريقو انتهائي اهم آهي.ڪالمن سينٽريفيوگل صاف ڪرڻ جو طريقو تيز ڪڍڻ جي رفتار آهي ۽ مؤثر طريقي سان ختم ڪري سگهي ٿو اهي نجاست جيڪي آر اين اي جي ايندڙ اينزيميٽڪ رد عمل کي متاثر ڪن ٿا، پر اهو مهانگو آهي (فورجين قيمتي قيمتي کٽ پيش ڪري سگهي ٿي، وڌيڪ تفصيل تي ڪلڪ ڪريوهتي؛اقتصادي ۽ شاندار صاف ڪرڻ جا طريقا استعمال ڪندي، جهڙوڪ LiCl ورن، پڻ اطمينان بخش نتيجا حاصل ڪري سگھن ٿا، پر آپريشن جو وقت ڊگهو آهي..

"ٽي نظم و ضبط ۽ اٺ ڌيان" آر اين اي ڪڍڻ لاء

نظم 1:exogenous enzymes جي آلودگي کي ختم ڪريو.

نوٽ 1:سختي سان ماسڪ ۽ دستانو پائڻ.

نوٽ 2:سينٽرفيوج ٽيوب، ٽِپ هيڊز، پائيپٽ راڊز، اليڪٽرروفورسس ٽينڪ ۽ تجرباتي بينچن کي چڱيءَ طرح ختم ڪيو وڃي.

نوٽ 3:تجربا ۾ شامل ريجنٽ/حل، خاص طور تي پاڻي، لازمي طور تي RNase کان پاڪ هجڻ گهرجي.

نظم 2:endogenous enzymes جي سرگرمي کي بلاڪ

نوٽ 4:مناسب homogenization جو طريقو چونڊيو.

نوٽ 5:هڪ مناسب lysate چونڊيو.

نوٽ 6:نموني جي شروعاتي مقدار کي ڪنٽرول ڪريو.

نظم 3:توهان جي ڪڍڻ جو مقصد واضح ڪريو

نوٽ 7:ڪنهن به lysate سسٽم سان نموني جي وڌ ۾ وڌ شروعاتي رقم جي ويجهو اچڻ سان، ڪڍڻ جي ڪاميابي جي شرح تيزيء سان گهٽجي ٿي.

نوٽ 8:ڪامياب آر اين اي ڪڍڻ جو واحد معاشي معيار بعد ۾ ڪيل تجربن ۾ ڪاميابي آهي، پيداوار نه.

RNase آلودگي جا مٿيان 10 ذريعا

1. آڱريون خارجي اينزائمز جو پهريون ذريعو آهن، تنهنڪري دستانو پائڻ لازمي آهي ۽ بار بار تبديل ڪرڻ گهرجي.ان کان علاوه، ماسڪ پڻ پائڻ لازمي آهي، ڇاڪاڻ ته سانس پڻ انزايم جو هڪ اهم ذريعو آهي.دستانو ماسڪ پائڻ جو هڪ اضافي فائدو تجربو ڪندڙ کي بچائڻ آهي.

2. پائيپٽ ٽوپس، سينٽريفيوج ٽيوب، پائپيٽ – RNase کي اڪيلي اسٽريلائيزيشن ذريعي غير فعال نٿو ڪري سگهجي، ان ڪري پائيپٽ ٽوپس ۽ سينٽريفيوج ٽيوبز کي DEPC سان علاج ڪيو وڃي، جيتوڻيڪ اهي نشان لڳل DEPC سان علاج ٿيل آهن.اهو بهتر آهي ته هڪ خاص مقصد واري پائيپٽ استعمال ڪريو، ان کي استعمال ڪرڻ کان اڳ 75٪ الڪوحل ڪپهه جي بال سان مسح ڪريو، خاص طور تي ڇنڊو؛اضافي طور تي، پڪ ڪريو ته سر هٽائڻ وارو استعمال نه ڪريو.

3. پاڻي/بفر لازمي RNase آلودگي کان پاڪ هجي.

4. گهٽ ۾ گهٽ ٽيسٽ ٽيبل کي 75 سيڪڙو الڪوحل ڪپهه جي بالن سان صاف ڪيو وڃي.

5.Endogenous RNase سڀني ٽشوز ۾ Endogenous اينزائمز شامل آهن، تنهنڪري مائع نائٽروجن سان ٽشوز کي جلدي منجمد ڪرڻ تباهي کي گهٽائڻ جو بهترين طريقو آهي.مائع نائيٽروجن رکڻ/پيسڻ جو طريقو واقعي مشڪل آهي، پر اهو ئي واحد طريقو آهي بافتن لاءِ جنهن ۾ اعليٰ سطحي انزائمز جي مقدار هوندي آهي.

6. آر اين اي جا نمونا آر اين اي ڪڍڻ واري مصنوعات ۾ شايد RNase آلودگي جا نشان شامل هوندا.

7. Plasmid extraction Plasmid extraction اڪثر ڪري RNA کي خراب ڪرڻ لاءِ Rnase استعمال ڪري ٿو، ۽ باقي رھندڙ Rnase کي Proteinase K سان ھضم ڪيو وڃي ۽ PCI ذريعي ڪڍيو وڃي.

8. آر اين اي اسٽوريج جيتوڻيڪ ان کي گهٽ درجه حرارت تي ذخيرو ڪيو وڃي ٿو، آر اين ايز جي مقدار کي نشانو بڻائڻ RNA جي تباهي جو سبب بڻجندو.آر اين اي جي ڊگھي مدت جي بچاءُ لاءِ بهترين حل لوڻ/شراب جي معطلي آهي، ڇاڪاڻ ته شراب گهٽ درجه حرارت تي تمام اينزيميٽڪ سرگرمي کي روڪي ٿو.

9. جڏهن ڪيشنز (Ca, Mg) اهي آئنز تي مشتمل هجن ته 80C تي 5 منٽن لاءِ گرم ڪرڻ سان آر اين اي ڪليو ٿي ويندو، تنهن ڪري جيڪڏهن آر اين اي کي گرم ڪرڻ جي ضرورت آهي ته بچاءُ واري حل ۾ چيليٽنگ ايجنٽ هجڻ گهرجي (1 ايم ايم سوڊيم سائٽريٽ، پي ايڇ 6.4).

10. ايندڙ تجربن ۾ استعمال ٿيندڙ اينزايمز RNase ذريعي آلوده ٿي سگھن ٿيون.

آر اين اي ڪڍڻ لاءِ 10 طريقا

1: جلدي روڪيو RNase سرگرمي.نموني گڏ ڪرڻ کان پوء جلدي منجمد ٿي ويا آهن، ۽ RNase lysis دوران تيز آپريشن ذريعي غير فعال ٿي ويندي آهي.

2: اعلي رائبوزائيم مواد سان ٽشوز لاء مناسب ڪڍڻ جو طريقو چونڊيو، ۽ adipose ٽشو استعمال ڪرڻ لاء بهترين طريقو فينول تي مشتمل آهي.

3: اڳڪٿي جي معيار کي اتر جي ضرورت آهي، cDNA لائبريري جي تعمير کي اعلي سالميت جي ضرورت آهي، ۽ RT-PCR ۽ RPA (Ribonuclease Protection Asay) کي اعلي سالميت جي ضرورت ناهي.RT-PCR کي اعلي پاڪائي جي ضرورت آهي (اينزائم انابيٽر جي باقيات).

4: مڪمل همراهائي پيداوار کي بهتر ڪرڻ ۽ تباهي کي گهٽائڻ جي ڪنجي آهي.

5: آر اين اي الیکٹروفورسس جي چڪاس جي سالميت جي جانچ ڪريو، 28S: 18S = 2:1 هڪ مڪمل نشاني آهي، 1:1 پڻ اڪثر تجربن لاءِ قابل قبول آهي.

6: RT-PCR لاءِ ڊي اين اي کي ختم ڪرڻ، سرن جو تجزيو DNA کي هٽائڻ لاءِ Dnase I استعمال ڪرڻ بهتر آهي.

7: exogenous enzymes جي آلودگي کي گھٽايو - اينزائيمز ٻاهران درآمد نه ٿي ڪري سگھجي.

8: جڏهن گهٽ ڪنسنٽريشن نيوڪليڪ ايسڊ کي وڌايو وڃي، هڪ گڏيل ورهاست ريگينٽ شامل ڪيو وڃي.پر انزايمز ۽ ڊي اين اي آلودگي تي مشتمل co-precipitant کي روڪڻ لاء.

9: آر اين اي کي چڱي طرح ٽوڙيو، جيڪڏهن ضروري هجي ته، 5 منٽن لاءِ 65 سينٽي گريڊ تي گرم ڪريو.

مناسب اسٽوريج جو طريقو

اهو ٿورڙي وقت لاءِ -20C تي ذخيرو ٿي سگهي ٿو، ۽ -80C تي گهڻي وقت تائين.آر اين اي جي پيداوار کي بهتر ڪرڻ ۾ پهريون قدم اهو محسوس ڪرڻ آهي ته مختلف نمونن جي آر اين اي مواد تمام گهڻو مختلف آهي.گھڻي مقدار (2-4ug/mg) جھڙوڪ جگر، پينڪرياز، دل، وچولي گھڻائي (0.05-2ug/mg) جھڙوڪ دماغ، جنين، گردو، ڦڦڙن، thymus، ovary، گھٽ مقدار (<0.05ug/mg) mg) جھڙوڪ مثانو، ھڏا، چربی.

1: آر اين کي ڇڏڻ لاءِ ليز سيلز - جيڪڏهن آر اين اي جاري نه ڪئي وئي ته پيداوار گهٽجي ويندي.اليڪٽرڪ هوموجنائيزيشن ٻين هوموجنائيزيشن طريقن جي ڀيٽ ۾ بهتر ڪم ڪري ٿي، پر شايد ٻين طريقن سان گڏ ٿيڻ جي ضرورت هجي، جهڙوڪ مائع نائٽروجن ميشنگ، اينزيميٽڪ هضم (Lysozyme/Lyticase)

2: ڪڍڻ واري طريقي جي اصلاح.فينول تي ٻڌل طريقن سان سڀ کان وڏو مسئلا نامڪمل سطحي ۽ جزوي آر اين اي نقصان آهن (سپرنٽنٽ مڪمل طور تي ختم نه ٿي ڪري سگھجي).نامڪمل سطحي جوڙجڪ اعليٰ نيوڪليڪ ايسڊ ۽ پروٽين جي مواد جي ڪري آهي، جيڪا استعمال ٿيل ليسٽ جي مقدار کي وڌائڻ يا نموني جي مقدار کي گهٽائڻ سان حل ڪري سگهجي ٿي.ڪلوروفارم ڪڍڻ جو هڪ قدم adipose ٽشو ۾ شامل ڪيو ويو.آر اين اي جي نقصان کي گھٽائي سگھجي ٿو پوئتي پمپنگ ذريعي يا نامياتي پرت کي هٽائڻ سان، بعد ۾ سينٽرفيوگريشن.ڪالمن سينٽرفيوگريشن تي ٻڌل طريقن سان سڀ کان وڏو مسئلو اضافي نموني آهي.

Classic Extraction Tips

1. فينول صاف ڪرڻ: 1:1 فينول / ڪلوروفارم جي برابر مقدار شامل ڪريو ۽ 1-2 منٽن لاء زور سان ملايو.2 منٽن لاء تيز رفتار تي Centrifuge.احتياط سان سپرنٽنٽ کي هٽايو (80-90٪).ڪڏهن به وچين پرت ڏانهن نه وڃو.رد عمل جي حل جو هڪ برابر مقدار Phenol/chloroform ۽ supernatant کي هٽائي ۾ شامل ڪري سگهجي ٿو.پيداوار کي بهتر ڪرڻ لاءِ نيوڪليڪ ايسڊ جي ورهاڱي لاءِ ٻن سپرنٽنٽن کي گڏ ڪري سگهجي ٿو.ملائڻ وقت تمام نرم نه ٿيو، ۽ سڀني سپرنٽنٽ کي هٽائڻ جي ڪوشش نه ڪريو.

2. 70-80٪ ايٿانول سان ڌوئڻ: ڌوئڻ دوران، نيوڪلڪ ايسڊ کي معطل ڪيو وڃي ته يقيني بڻائين ته باقي لوڻ ڌوئي وڃي.ساڳئي وقت، ايٿانول کي بند ڪرڻ کان پوء، ڪجهه سيڪنڊن لاء تيز رفتار تي سينٽرفيوج، ۽ پوء پائيپٽ سان بچيل ايٿانول کي هٽايو.5-10 منٽن لاء ڪمري جي حرارت تي بيهڻ کان پوء حل ڪريو.

11. خاص تنظيمن جي اضافي

1. فائبرس ٽشو: فائبرس ٽشوز مان آر اين اي ڪڍڻ جي ڪنجي جيئن ته دل/اسڪيليٽل عضلاتي ٽشو کي مڪمل طور تي خراب ڪرڻ آهي.انهن بافتن ۾ سيل جي کثافت گهٽ هوندي آهي، تنهن ڪري آر اين اي جي مقدار في يونٽ ٽشو وزن گهٽ هوندي آهي، ۽ اهو بهتر آهي ته جيترو ٿي سگهي استعمال ڪيو وڃي.پڪ ڪريو ته ٽشو کي چڱي طرح منجمد حالتن ۾ پيس ڪريو.

2. اعليٰ پروٽين/چربي مواد سان ٽشوز: دماغ/ سبزي جي ٿلهي جو مواد تمام گهڻو آهي.PCI ڪڍڻ کان پوء، supernatant ۾ اڇو floccules شامل آهن.سپرنٽنٽ کي ڪلوروفارم سان ٻيهر ڪڍڻ گهرجي.

3. ٽشوز جن ۾ نيوڪليڪ ايسڊ/رائبوزائيم مواد وڌيڪ هوندو آهي: اسپلين/ٿيمس ۾ نيوڪليڪ ايسڊ ۽ رائبوزيم مواد وڌيڪ هوندو آهي.ٿڌ جي حالتن هيٺ ٽشو کي پيسائڻ ۽ بعد ۾ تيزيءَ سان هوموجنائيزيشن رائبوزائمز کي مؤثر طريقي سان غير فعال ڪري سگهي ٿي.تنهن هوندي به، جيڪڏهن lysate تمام viscous آهي (هاء nucleic ايسڊ مواد جي ڪري)، PCI extracting اثرائتو stratify ڪرڻ جي قابل نه ٿيندو؛وڌيڪ lysate شامل ڪرڻ هن مسئلي کي حل ڪري سگهي ٿو.گھڻن پي سي آئي ڪڍڻ وارا وڌيڪ بقايا ڊي اين اي ختم ڪري سگھن ٿا.جيڪڏهن شراب شامل ڪرڻ کان پوء فوري طور تي هڪ اڇو ورهايو وڃي، اهو ڊي اين اي آلودگي کي ظاهر ڪري ٿو.تيزابي PCI سان ٻيهر ڪڍڻ کان پوءِ ڊي اين اي آلودگي کي ختم ڪري سگھي ٿو.

4. ٻوٽي جو بافتو: ٻوٽن جو بافتو جانورن جي بافتن کان وڌيڪ پيچيده هوندو آهي.عام طور تي، ٻوٽا مائع نائٽروجن جي حالتن هيٺ زمين تي هوندا آهن، تنهنڪري آر اين اي کي ختم ٿيڻ واري اينزيميمس غير معمولي آهي.جيڪڏهن تباهي جو مسئلو حل نه ڪيو ويو آهي، اهو تقريبا يقيني طور تي نموني ۾ موجود تڪليف جي سبب آهي.ڪيترن ئي ٻوٽن ۾ موجود نجاست رهجي وڃڻ جو سبب بڻجندي آهي، ۽ رهجي وڃڻ جو سبب گهڻو ڪري اهو هوندو آهي ته اهي نجاست آر اين اي سان ڪجهه هڪجهڙائي رکن ٿيون: توهان ورن ٿا ۽ آئون ورجائي ٿو، ۽ توهان جذب ڪيو ۽ آئون جذب ڪريان ٿو.اهي خاصيتون طئي ڪن ٿيون ته اهي ڏاڍا مضبوط اينزائم انابيٽرز آهن.

في الحال، تجارتي آر اين اي ڪڍڻ وارا ريجينٽ تقريبن سڀني جانورن جي بافتن کي ننڍڙن ترميمن سان ترتيب ڏئي سگهجن ٿا، پر ڪجھه تجارتي آر اين اي ڪڍڻ وارا ريجينٽ آهن جيڪي اڪثر ٻوٽن جي بافتن لاءِ موزون ٿي سگهن ٿا.خوشقسمتيء سان، Foregene خاص مهيا ڪري سگهو ٿاپلانٽ آر اين اي ڪڍڻ واري ڪٽ، اسان کي آهيپلانٽ ٽوٽل آر اين اي آئسوليشن کٽ, پلانٽ ٽوٽل آر اين اي آئسوليشن ڪٽ پلس.جنهنڪري خاص طور تي ٻوٽن لاءِ ٺهيل آهي اعليٰ پوليسڪچرائيڊ ۽ پوليفينول مواد.آر اين اي ڪڍڻ لاءِ، ليبارٽري استعمال ڪندڙن کان موٽ خاص طور تي سٺي آهي.

12. نموني منجمد ٿيڻ ۽ پگھلڻ جو اثر منجمد نمونو وڏو ٿي سگھي ٿو، ۽ RNA ڪڍڻ لاءِ استعمال ٿيڻ کان اڳ ان کي ڪٽيو وڃي.ڪٽڻ دوران نمونا (ممڪن طور تي جزوي طور) ڳري ويندا آهن.آر اين اي ڪڍڻ کان اڳ منجمد نمونن کي وزن ڏيڻ جي ضرورت پوندي، ۽ ان عمل دوران پگھلڻ ضرور ٿيندو.ڪڏهن ڪڏهن، نموني جو پگھلڻ به مائع نائٽروجن ملنگ جي عمل دوران ٿئي ٿو؛يا منجمد نموني کي مائع نائٽروجن ملنگ کان سواءِ سڌي طرح lysate ۾ شامل ڪيو ويندو آهي، ۽ ٿڌڻ يقيني طور تي مڪمل هوموجنائيزيشن کان اڳ ٿيندو.تجربن مان معلوم ٿيو آهي ته منجهيل ٽشو تازو ٽشوز جي ڀيٽ ۾ پگھلڻ دوران آر اين اي جي خراب ٿيڻ جو وڌيڪ خطرو آهي.امڪاني سبب: منجمد ٿيڻ وارو عمل سيل جي اندر جي جوڙجڪ ۾ خلل پيدا ڪري ٿو، ان کي آسان بڻائي ٿو ته انزائيمس جو آر اين اي سان سڌو رابطو ۾ اچي.

13. آر اين اي جي معيار جو فيصلو عام طور تي، الیکٹروفورسس استعمال ڪيو ويندو آهي آر اين اي جي سالميت جو فيصلو ڪرڻ لاء، ۽ A260/A280 استعمال ڪيو ويندو آهي آر اين اي جي خالصيت کي فيصلو ڪرڻ لاء.نظريي ۾، برقرار RNA جو تناسب 28S:18S = 2.7:1 آهي، ۽ اڪثر ڊيٽا 28S:18S = 2:1 جي تناسب تي زور ڏئي ٿو.حقيقت اها آهي ته سيلز کان سواءِ نمونن مان نڪتل تقريبن ڪو به آر اين اي 2:1 جي تناسب ۾ نه آهي (اهو Agilent Bioanalyzer استعمال ڪندي حاصل ڪيو ويو).

RNA جا الیکٹروفورسس جا نتيجا ڪيترن ئي عنصرن کان متاثر ٿين ٿا، جن ۾ ثانوي ڍانچي، اليڪٽرروفورسس حالتون، نموني لوڊ، اي بي پاران سنترپت جو درجو وغيره شامل آهن. آر اين اي کي ڳولڻ لاءِ مقامي اليڪٽرروفورسس استعمال ڪريو ۽ ڊي اين اي مارڪر کي ڪنٽرول طور استعمال ڪريو.جيڪڏهن 28S 2kb تي ۽ 18S 0.9kb تي واضح آهن، ۽ 28S: 18S > 1، سالميت اڪثر ايندڙ تجربن جي گهرجن کي پورو ڪري سگهي ٿي.

A260/A280 هڪ اشارو آهي جيڪو تمام گهڻو مونجهارو پيدا ڪيو آهي.سڀ کان پهريان، اهو ضروري آهي ته هن اشاري جي اصلي معني کي واضح ڪرڻ لاء نيوڪليڪ اسيد لاء: خالص آر اين اي، ان جي A260/280 = اٽڪل 2.0.خالص آر اين اي 'سبب' آهي ۽ A260/A280 = 2 'اثر' آهي.هاڻي هر ڪو A260/A280 کي ’سبب‘ طور استعمال ڪري رهيو آهي، اهو سوچي رهيو آهي ته ”جيڪڏهن A260/A280 = 2، ته پوءِ آر اين اي خالص آهي“، جيڪو قدرتي طور مونجهاري جو سبب بڻجي ٿو.

جيڪڏھن توھان چاھيو ٿا، توھان شامل ڪري سگھوٿا ٿورڙو ريجنٽ جيڪو اڪثر ڪڍڻ ۾ استعمال ٿيندو آھي، جھڙوڪ phenol، guanidine isothiocyanate، PEG، وغيره، پنھنجي RNA نموني ۾، ۽ پوءِ ماپ ڪريو A260/A280 تناسب.حقيقت اها آهي ته آر اين اي ڪڍڻ لاءِ استعمال ٿيندڙ ڪيترائي ريجنٽ، گڏوگڏ نموني ۾ ڪيتريون ئي نجاستون، A260 ۽ A280 جي چوڌاري جذب ٿين ٿيون، A260/A280 کي متاثر ڪن ٿيون.

هن وقت سڀ کان وڌيڪ سبق آموز طريقو 200-300 nm رينج ۾ آر اين اي نموني کي اسڪين ڪرڻ آهي.خالص RNA جي وکر ۾ ھيٺيون خاصيتون آھن: وکر هموار آھي، A230 ۽ A260 ٻه انفڪشن پوائنٽ آھن، A300 0 جي ويجھو آھي، A260/A280 = 2.0 جي ويجهو، ۽ A260/A230 = 2.0 جي چوڌاري.جيڪڏهن اسڪين ڊيٽا موجود نه آهن، A260/A230 تناسب پڻ طئي ڪيو وڃي، ڇاڪاڻ ته اهو تناسب سڀني نجاستن کي کڻڻ لاء وڌيڪ حساس آهي جيڪو اينزيميٽڪ ردعمل کي متاثر ڪري ٿو.اڪائونٽ ۾ ڊوائيس جي لڪير واري حد (0.1-0.5 A260 لاء) وٺو.

اتي ٻه ٻيا مفيد واقعا آھن: تناسب اٽڪل 0.3 گھٽ ھوندو جڏھن A260/A280 پاڻيءَ ۾ ماپيو ويندو.جڏهن ته 10 ايم ايم EDTA ۾ ماپيل تناسب اٽڪل 0.2 وڌيڪ آهي 1 ايم ايم اي ڊي ٽي اي ۾ ماپيل.

لاڳاپيل مصنوعات:

چائنا پلانٽ ٽوٽل آر اين اي آئسوليشن کٽ ٺاھيندڙ ۽ فراهم ڪندڙ |Foregene (foreivd.com)

آر اين اي آئسوليشن سيريز سپلائرز ۽ فيڪٽري |چين آر اين اي آئسوليشن سيريز ٺاهيندڙن (foreivd.com)

آر اين اي آئسوليشن سيريز - فارگيني ڪمپني لميٽيڊ (foreivd.com)