RT-qPCR جي تجربي ۾ آر اين اي ڪڍڻ ۽ معيار جو جائزو، ريورس ٽرانسڪرپشن ۽ qPCR ٽي مرحلا شامل آهن، هر قدم ۾ تمام گهڻيون احتياطون آهن، اسان هيٺ تفصيل سان تعارف ڪنداسين.

Ⅰ .آر اين اي معيار جو جائزو

RT-qPCR تجربن ۾، آر اين اي ڪڍڻ جي مڪمل ٿيڻ کان پوء، آر اين اي جي معيار کي جانچڻ جي ضرورت آهي، ۽ فالو اپ تجربو صرف ان جي قابل ٿيڻ کان پوء ڪري سگهجي ٿو.تشخيص جي طريقن ۾ شامل آهن اسپيڪٽروفوٽوميٽر، Agilent gel electrophoresis، Agilent 2100 analysis، جن مان سڀ کان وڌيڪ استعمال ٿيل اسپيڪٽروفوٽوميٽر ۽ agarose gel electrophoresis طريقو معلوم ڪرڻ.اهو ياد رکڻ گهرجي ته انهن ٻنهي طريقن کي گڏ ڪرڻ جي ضرورت آهي ته جيئن آر اين اي ڪنسنٽريشن، خالصيت ۽ سالميت جي چڪاس ۽ تجزيو مڪمل ڪرڻ لاءِ، جيئن آر اين اي جي معيار کي يقيني بڻائي سگهجي.

لاڳاپيل آر اين اي آئسوليشن کٽ: 

Cell Total RNA Isolation Kit

انتهائي پاڪ ۽ اعليٰ معيار جي ڪل آر اين اي 11 منٽ ۾ مختلف ڪلچر ٿيل سيلن مان حاصل ڪري سگھجن ٿا.

جانورن جي ڪل آر اين اي آئسوليشن کٽ

جلدي ۽ موثر طور تي مختلف جانورن جي بافتن مان اعليٰ پاڪائي ۽ اعليٰ معيار جي ڪل آر اين اي ڪڍيو.

spectrophotometer:

اسپيڪٽرفوٽوميٽر خاص طور تي استعمال ڪيو ويندو آهي آر اين اي جي ڪنسنٽريشن ۽ پاڪيزگي کي طئي ڪرڻ لاءِ، پر اهو آر اين اي ۽ جينومڪ ريزيديو جي سالميت کي معلوم نٿو ڪري سگهي.انهن مان، A260/280 ۽ A260/230 آر اين اي جي صفائي جي سڃاڻپ لاء اهم پيٽرولر آهن، ۽ آر اين اي پاڪائي انهن جي قيمتن جي وهڪري جي مطابق ڳولي سگهجي ٿي:

1. 1.9< A260/280< 2.1، اشارو ڪري ٿو ته آر اين اي پاڪائي سٺي آهي؛A260/280<1.9، ظاھر ڪري ٿو ته RNA ۾ پروٽين جي رھائش ٿي سگھي ٿي؛A260/280> 2.1، آر اين اي جي ممڪن جزوي تباهي جو اشارو ڏئي ٿو، جيڪا وڌيڪ تصديق ڪري سگهجي ٿي agarose gel electrophoresis.

2. 2.0< A260/230< 2.2، اشارو ڪري ٿو ته آر اين اي پاڪائي سٺي آهي؛A260/230< 2.0، ظاهر ڪري ٿو ته ٿي سگهي ٿو آر اين اي ۾ نامياتي ريجينٽس جا باقي بچيل، جهڙوڪ فينول، ايٿانول يا شگر.

Agarose gel electrophoresis:

Agarose gel electrophoresis assay آر اين اي جي سالميت، جينوم ۽ پروٽين جي باقيات جو تجزيو ڪري سگهي ٿو، پر آر اين اي جي ڪنسنٽريشن کي صحيح انداز ۾ نه ٿو معلوم ڪري سگهي يا نامياتي ريجينٽس جي باقيات کي ڳولي سگهي ٿو.مثال طور eukaryotic RNA ٽيمپليٽ وٺو:

1. آر اين اي ايگرز جيل الیکٹروفورسس جي تابع هئي.جيڪڏهن جيل نقشي تي 28sRNA، 18sRNA ۽ 5.8sRNA جا فقط ٽي واحد بينڊ هئا، ته اهو ظاهر ڪري ٿو ته ڪڍيل آر اين اي برقرار آهي.جيڪڏهن هڪ ڇڪڻ وارو رجحان آهي، اهو اشارو ڪري ٿو ته آر اين اي جي جزوي تباهي.

2. جيڪڏهن گلو سوراخ ۽ 28sRNA بينڊ جي وچ ۾ هڪ واحد روشن بينڊ آهي، اتي جينومڪ ڊي اين اي باقي رهي سگهي ٿي.

3. جيڪڏهن گلو جي سوراخ ۾ بينڊ ظاهر ٿين ٿا، اهو ظاهر ڪري ٿو ته اتي پروٽين ۽ ٻين ميڪروموليڪيولر مادو جا رهجي ويا هوندا.

Ⅱ. ريورس ٽرانسپشن

آر اين اي ڪڍڻ مڪمل ٿيڻ کان پوءِ، ان کي ايندڙ تجربن لاءِ سي ڊي اين اي ۾ تبديل ڪرڻ جي ضرورت آهي، ان ڪري ريورسل قدم ضروري آهي.ريورس ٽرانسڪرپشن کي متعارف ڪرايو ويندو ريورس ٽرانسڪرپٽ ۽ پرائمر جي چونڊ مان:

ريورس ٽرانسڪرپٽ چونڊ:

عام ريورس ٽرانسپيسس شامل آهن AMV RTase ۽ MMLV RTase.AMV RTase جي RNase H ۾ مضبوط سرگرمي، مختصر جوڙجڪ جي ڊيگهه، گھٽ ٺاھڻ جي مقدار ۽ سٺي حرارتي استحڪام (42 ~ 55℃).MMLV RTase جي RNase H سرگرمي ڪمزور آهي، ٺهڪندڙ ڊگھي ڊگھي آھي، ٺاھڻ جي مقدار اعلي آھي، ۽ حرارتي استحڪام خراب آھي (37 ~ 42℃).

ڇاڪاڻ ته RNase H enzyme ۾ RNA ٽيمپليٽ کي خراب ڪرڻ جو ڪم آهي، ڪمزور RNase H سرگرمي سان MMLV کي ترجيحي طور تي ريورس ٽرانسپشن دوران چونڊيو وڃي، ۽ بعد ۾ جينياتي انجنيئرنگ کان پوء، MMLV جي حرارتي استحڪام کي قابليت واري ليپ تي پهچي چڪو آهي.Foregene وٺڻForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV ريورس ٽرانسڪرپشن لاءِ) مثال طور، اھو ھڪڙو نئون ريورس ٽرانسڪرپٽ آھي جيڪو E. coli انجنيئر ٿيل بيڪٽيريا ۾ بيان ڪيو ويو آھي جينياتي ريڪبينيشن ٽيڪنالاجي استعمال ڪندي.اهو هڪ recombinant ڊي اين اي پوليمريز آهي جيڪو هڪ مڪمل ٿيل ڊي اين اي اسٽرينڊ کي سنگل اسٽرينڊڊ آر اين اي، ڊي اين اي، يا آر اين اي: ڊي اين اي هائبرڊ مان گڏ ڪري ٿو.ان ۾ ڪا RNase H سرگرمي، مضبوط استحڪام، مضبوط RNA لاڳاپو، ۽ اعلي چڪاس جي حساسيت ناهي.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV ريورس ٽرانسڪرپشن لاءِ)

پرائمر جي چونڊ:

عام طور تي RT پرائمر ٽن ڀاڱن ۾ اچي وڃن ٿا: oligo dT، random primers، ۽ gene-specific primers.مختلف تجرباتي گهرجن مطابق استعمال لاءِ مناسب پرائمر چونڊيو.

1. جيڪڏهن ٽيمپليٽ يوڪريوٽڪ اصل جو آهي ۽ دير واري سي ڊي اين اي کي روٽين پي سي آر ايمپليفڪيشن لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي، اوليگو (dT) سفارش ڪئي ويندي آهي؛جيڪڏهن ايندڙ تجربو صرف qPCR لاءِ استعمال ڪيو وڃي، اوليگو (dT) کي سفارش ڪئي وئي آهي ته بي ترتيب پرائمر سان ملايو وڃي ته جيئن ريورس ٽرانسپشن جي ڪارڪردگي کي بهتر بڻائي سگهجي.

2. جيڪڏهن ٽيمپليٽ پروڪاريوٽس مان آهي، ريورس ٽرانسپشن لاءِ رينڊم پرائمر يا جين مخصوص پرائمر چونڊڻ گهرجن.

Ⅲ.qPCR

fluorescence quantification خاص طور تي quantitative طريقن جي چونڊ، پرائمر ڊيزائن جي اصولن، ROX چونڊ، رد عمل سسٽم جي ترتيب ۽ رد عمل جي حالتن جي سيٽنگ، وغيره مان وضاحت ڪئي وئي آهي.

مقدار جي طريقن جي چونڊ:

مقداري طريقن کي ورهايو ويو آھي لاڳاپا مقداري طريقن ۽ مطلق مقداري طريقن ۾.جين جي اظهار تي خاص علاج جي طريقن جي اثر کي معلوم ڪرڻ لاءِ، مختلف وقتن تي جين جي اظهار جي فرق کي معلوم ڪرڻ ۽ مختلف بافتن ۾ جين جي اظهار جي فرق کي ڀيٽڻ لاءِ استعمال ڪري سگهجي ٿو.مڪمل مقدار جي تصديق وائرس ۾ نيوڪليڪ ايسڊ جي مقدار کي ڳولي سگھي ٿو وغيره.جڏهن تجربا ڪري رهيا آهيون، اسان کي اسان جي پنهنجي تجربن جي مطابق مناسب مقدار جي طريقن کي چونڊڻ گهرجي.

پرائمري ڊيزائن جا اصول:

qPCR لاءِ پرائمر جي ڊيزائن سڌو سنئون ايمپليفڪيشن جي ڪارڪردگي ۽ پيداوار جي خاصيت سان لاڳاپيل آهي.تنهن ڪري، صحيح نموني ڊزائين ڪرڻ سٺو پرائمر ڪامياب qPCR جو پهريون قدم آهي.پرائمر جي ڊيزائن ۾، هيٺين اصولن تي ڌيان ڏيڻ گهرجي جڏهن روايتي پرائمر ڊيزائن جي اصول کي پورا ڪندي:

1. ھدف واري ٽڪري جي ڊيگهه 100 ۽ 300 بي پي جي وچ ۾ ڪنٽرول ڪئي وئي آھي.

2. جينومڪ ڊي اين اي جي اثر کان بچڻ لاءِ ڪراس-ايڪسون ڊيزائن؛

3. ڊزائين ڪيل پرائمر کي ايمپليفڪيشن جي ڪارڪردگيءَ لاءِ جانچڻ جي ضرورت آھي، ۽ رڳو جڏھن امپليفڪيشن ڪارڪردگي معيار تي پھچي (90-110٪) اھي مقداري تجربن لاءِ استعمال ٿي سگھن ٿا؛

4. پرائمر ڪنسنٽريشن عام طور تي 0.1uM ۽ 1.0uM جي وچ ۾ بهتر ڪيو ويندو آهي.

جي چونڊROX:

مقدار جي رد عمل جي عمل ۾، ROX نظرياتي رستي جي فرق کي ترتيب ڏئي سگھي ٿو، پائپنگ جي غلطي يا حجم جي فرق جي ڪري evaporation ۽ ڪنسنسيشن جي ڪري هڪجهڙائي سان، نتيجن جي ورهاڱي کي بهتر بڻائي.بهرحال، اهو ياد رکڻ گهرجي ته ROX جو انتخاب اوزار سان لاڳاپيل آهي.جيڪڏهن qPCR اوزار کي خودڪار طور تي سوراخ جي وچ ۾ فرق کي درست ڪرڻ جو ڪم آهي، ان کي ROX شامل ڪرڻ جي ضرورت ناهي؛ٻي صورت ۾، ان کي ROX اصلاح شامل ڪرڻ جي ضرورت آهي.Reagents خريد ڪرڻ ۾ ننڍا ڀائيوار لازمي طور تي صحيح ROX چونڊڻ لاء استعمال ٿيل اوزار جي مطابق هجن، بعد ۾ غلطي کان بچڻ.

ردعمل سسٽم جي تياري:

20ul ۽ 50ul جي رد عمل جي مقدار کي ترجيح ڏني وئي آھي.جڏهن نظام کي ترتيب ڏنو وڃي ته هيٺين معاملن تي ڌيان ڏيڻ گهرجي:

1. رد عمل سسٽم کي الٽرا صاف ڪم بينچ ۾ وينٽيليشن ذريعي تيار ڪرڻ جي ضرورت آهي، نئين ڊي ڊي ايڇ₂O استعمال ڪيو ويندو آهي هر تجربي لاءِ؛

2. هر تجربي کي NTC تيار ڪرڻ جي ضرورت آهي ان جي تصديق ڪرڻ لاءِ ته ڇا سسٽم ۾ آلودگي آهي، ۽ سسٽم کي تيار ڪرڻ وقت پرائمر جي هر جوڙي کي NTC ڪرڻ جي ضرورت آهي؛

3. اهو معلوم ڪرڻ لاءِ ته ڇا آر اين اي ٽيمپليٽ ۾ جي ڊي اين اي جي باقيات موجود آهي، هر نموني لاءِ NRT تيار ڪري سگهجي ٿو.

4. سسٽم کي تيار ڪرڻ وقت، هڪ نموني لاء گهٽ ۾ گهٽ 3 ٽيڪنيڪل ورجائڻ جي سفارش ڪئي وئي آهي؛

5. جڏهن ٽيمپليٽ cDNA آهي، ان کي 5-10 ڀيرا گھٽائڻ جي صلاح ڏني وئي آهي ته جيئن qPCR تجربن تي ريورس ٽرانسپشن سسٽم جي منع ٿيل اثر کي گھٽايو وڃي.اهو بهتر آهي ته ٽيمپليٽ جي مقدار کي گريجوئيٽ جي ذريعي ڳوليو، ته جيئن CT جي قيمت 20-30 جي وچ ۾ پوي.

6. رد عمل جي گهربل تعداد جو اندازو لڳايو، رد عمل جي تعداد جي بنياد تي 5-10٪ وڌايو، ۽ حجم جي ترتيب واري نمبر کي ڳڻيو؛

7، سسٽم کي پريمڪس اصول استعمال ڪندي تيار ڪيو ويو آهي، سينٽرفيوگريشن کان پوء ملائڻ ۽ بلبل نه هجڻ کي يقيني بڻائي؛

8، جيترو ممڪن طور تي قابل استعمال سامان چونڊڻ لاء.

لاڳاپيل RT-qPCR کٽ