تشخيص جي خصوصيت
اڪثر ڪيسن ۾، پرائمر ڊيزائن جو مقصد پي سي آر جي خاصيت کي وڌائڻ آهي.اهو ڪيترن ئي متغيرن جي وڌيڪ يا گهٽ پيش گوئي واري اثر جي ذريعي طئي ڪيو ويو آهي.هڪ اهم متغير پرائمر جي 3′آخر ۾ ترتيب آهي.
خاص طور تي، خاصيت لاءِ ٺاهيل پي سي آر اسيسز هڪ وسيع متحرڪ رينج تي اعليٰ ڪارڪردگي کي برقرار رکڻ جو وڌيڪ امڪان آهي، ڇاڪاڻ ته اهو پرک غير مخصوص ايمپليفڪيشن پراڊڪٽس پيدا نٿو ڪري، ان ڪري پي سي آر ريجنٽ سان مقابلو ڪري ٿو يا مکيه امپليفڪيشن رد عمل کي روڪي ٿو.
يقينن، ڪجهه حالتن ۾، خاصيت سڀ کان اهم نه آهي، مثال طور، جڏهن مقصد ويجهي لاڳاپيل پر مختلف پيجنجنز کي مقدار ڏيڻ آهي، خاص ڊيزائن، اصلاح ۽ تصديق جي معيار جي ضرورت هوندي آهي.
پگھلڻ وارو وکر amplicons جي خاصيت جو اندازو لڳائڻ لاءِ هڪ معياري طريقو آهي، گهٽ ۾ گهٽ ان لحاظ کان ته ڇا هڪ ٽارگيٽ کي وڌائڻو آهي.بهرحال، اهو زور ڀريو وڃي ٿو ته پگھلڻ واري وکر گمراهه ٿي سگهي ٿي، ڇاڪاڻ ته، مثال طور، اهي متاثر ٿي سگهن ٿا گڏيل اثرات جي گڏيل اثرات ۽ گهٽ ٽيمپليٽ ڪنسنٽريشن.
P5 |پگھلڻ وارو وکر ٻن ٽارگيٽ ڊي اين ايز جي مختلف مقدارن جي ٻن دريافتن مان حاصل ڪيل Tm شفٽ کي ڏيکاري ٿو.
A. وڌيڪ ڪنسنٽريشن تي (ad))، qPCR جي ماپ مڪمل ٿيڻ کان پوءِ ڪو به واضح پرائمر ڊائمر نه آهي.جيئن ته ٽيمپليٽ جي ڪنسنٽريشن 50 ڪاپيز (e) تائين گهٽجي ٿي، هڪ غير مخصوص پراڊڪٽ ظاهر ٿيڻ شروع ٿئي ٿو ۽ صرف پراڊڪٽ بڻجي وڃي ٿو سڀ کان گهٽ ڪنسنٽريشن (f).
B. ٽيسٽ ساڳئي Tms کي سڀني ٽارگيٽ ڪنسنٽريشن تي رڪارڊ ڪيو، ۽ ڪو به واضح پرائمر ڊائمر نه هو جيتوڻيڪ گهٽ ۾ گهٽ ڪنسنٽريشن تي (5 ڪاپيون).جڏهن اهي ٻه ڳولڻ جا طريقا استعمال ڪندا، اين ٽي سيز ۾ ڪو به واڌارو پراڊڪٽ نه مليا.
P5 نمونن سان حاصل ڪيل تحليل وکر ڏيکاري ٿو جنهن ۾ ٽيمپليٽ مختلف ڪنسنٽريشن تي موجود آهي.P 5a ڏيکاري ٿو ته ٻن تمام گھٽ ڪنسنٽريشن تي، غير مخصوص ايمپليفڪيشن پراڊڪٽس جو Tms پيدا ٿيل مخصوص amplicons جي ڀيٽ ۾ گھٽ آھي.
ظاهر آهي، اهو ڳولڻ جو طريقو قابل اعتماد طور استعمال نه ٿو ڪري سگهجي ته اهڙن مقصدن کي ڳولڻ لاء جيڪي گهٽ ڪنسنٽريشن ۾ موجود آهن.
دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، NTCs، يعني، ڊي اين اي سان گڏ نمونا، رڪارڊ نه ڪيا ويا (غير مخصوص) ايمپليفڪيشن پراڊڪٽس، اهو ظاهر ڪري ٿو ته پس منظر جينومڪ ڊي اين اي غير مخصوص ايمپليفڪيشن/پوليمرائيزيشن ۾ حصو وٺي سگھي ٿو.
ڪڏهن ڪڏهن اهڙن پس منظر جي پرائمر ۽ غير مخصوص ايمپليفڪيشن جو علاج نه ٿو ڪري سگهجي، پر اهو اڪثر ڪري ممڪن آهي ته هڪ اهڙي سڃاڻپ جو طريقو ٺاهيو جنهن ۾ ڪنهن به ٽيمپليٽ ڪنسنٽريشن ۽ NTC (P 5b) ۾ غير مخصوص واڌارو نه هجي.
هتي، 35 جي Cq سان ٽارگيٽ ڪنسنٽريشن جي واڌ ويجهه کي به رڪارڊ ڪرڻ سان هڪ مخصوص تحليل وکر پيدا ٿيندو.اهڙي طرح، اين ٽي سيز غير مخصوص واڌ جي ڪا نشاني ظاهر نه ڪئي.ڪڏهن ڪڏهن، ڳولڻ واري رويي جو دارومدار ماء جي شراب تي ٿي سگهي ٿو، ۽ صرف غير مخصوص واڌارو ڪجهه خاص بفر مرکبن ۾ معلوم ٿئي ٿو، جيڪو مختلف Mg2 + ڪنسنٽريشن سان لاڳاپيل ٿي سگهي ٿو.
تشخيص جي استحڪام
Ta جي اصلاح qPCR ڳولڻ جي تجرباتي تصديق ۽ اصلاح جي عمل ۾ هڪ مفيد قدم آهي.اهو درجه حرارت (يا درجه حرارت جي حد) ڏيکاريندي پرائمر سيٽ جي مضبوطي جو سڌو اشارو ڏئي ٿو جيڪو NTC کي وڌائڻ کان سواءِ گھٽ ۾ گھٽ Cq پيدا ڪري ٿو.
حساسيت ۾ ٻه کان چار گنا فرق شايد انهن ماڻهن لاءِ اهم نه هجي جن جي اعلي ايم آر اين اي اظهار هجي، پر تشخيصي ٽيسٽن لاءِ، ان جو مطلب ٿي سگهي ٿو مثبت ۽ غلط منفي نتيجن جي وچ ۾ فرق.
qPCR پرائمر جا Ta خاصيتون مختلف ٿي سگهن ٿا.ڪجهه ٽيسٽ تمام مضبوط نه هوندا آهن، ۽ جيڪڏهن اهي پرائمر جي بهترين Ta قدر هيٺ نه ڪيا ويا آهن، اهي جلدي ختم ٿي ويندا.
اهو ضروري آهي ڇو ته هن قسم جي سڃاڻپ اڪثر ڪري حقيقي دنيا ۾ مشڪل آهي، ۽ نموني جي پاڪائي، ڊي اين اي جي ڪنسنٽريشن، يا ٻين ڊي اين اي جي موجودگي شايد بهتر نه هجي.
ان کان علاوه، ٽارگيٽ ڪاپي نمبر وڏي حد ۾ مختلف ٿي سگھي ٿو، ۽ ريجنٽ، پلاسٽڪ جي برتن، يا اوزار انھن کان مختلف ٿي سگھي ٿو جيڪي ٽيسٽ قائم ڪرڻ وقت استعمال ڪيا ويندا آھن.
P6
A. انساني دماغ جي RNA مان تيار ڪيل cDNA تي PCR ڪرڻ لاءِ Bioline's Sensifast SYBR ماسٽرمڪس (ڪيٽلاگ نمبر BIO-98050) استعمال ڪريو.
ب. استعمال ڪريو Bio-Rad جي CFX qPCR اوزار کي رڪارڊ ڪرڻ لاءِ ايمپليفڪيشن نقشو ۽ اپليني جي تحلیل وکر (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGTGGTGATCTCCTAGG).
C. ACSBG1 (NM_015162.4، F: CTACACTTCGGGCACCACTGG، R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. GFAP (NM_002055.5، F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG، R: CGAACCTCCTCTCGTGGATCTTC) جو ايمپليفڪيشن گراف ۽ تحليل وکر.
E. Cqs مختلف annealing گرمي پد تي رڪارڊ ڪيو ويو، Cq ۾ فرق ڏيکاريندي 7C گرمي پد جي گريڊينٽ هيٺ رڪارڊ ڪيو ويو.
P 6 هڪ اڻ وڻندڙ امتحان جو هڪ عام نتيجو ڏيکاري ٿو، جتي qPCR 59C ۽ 67C (P 6a) جي وچ ۾ گريڊينٽ ٽاس استعمال ڪندي، ٽن انساني دماغ جي مخصوص جين لاء پرائمر استعمال ڪندي ڪيو ويو.
اهو ايمپليفڪيشن گراف مان ڏسي سگهجي ٿو ته اوپيلين پرائمر مثالي کان پري آهن ڇاڪاڻ ته انهن جي بهترين Ta رينج تمام تنگ آهي (شڪل 6b)، يعني، Cqs وڏي پيماني تي منتشر آهن، جنهن جي نتيجي ۾ Cqs انهن جي بهتر ترين Cqs جي مقابلي ۾ تمام گهٽ آهن.
اهو ڳولڻ جو طريقو غير مستحڪم آهي ۽ شايد suboptimal amplification جي ڪري سگھي ٿو.تنهن ڪري، پرائمر جو هي جوڙو ٻيهر ڊزائين ڪيو وڃي.ان کان علاوه، پگھلڻ واري وکر جو تجزيو (انسيٽ) ڏيکاري ٿو ته هن ڳولڻ واري طريقي جي خاصيت پڻ مشڪل ٿي سگهي ٿي، ڇاڪاڻ ته هر Ta جي پگھلڻ واري وکر مختلف آهي.
P 6c ۾ ڏيکاريل ACSBG1 ڳولڻ جو طريقو مٿي ڏنل Opalin ڳولڻ واري طريقي کان وڌيڪ مضبوط آهي، پر اهو اڃا تائين مثالي کان پري آهي، ۽ ممڪن آهي ته اهو بهتر ٿي سگهي ٿو.
بهرحال، اسان زور ڀريو ٿا ته مضبوطي ۽ خاصيت جي وچ ۾ ڪو به ضروري تعلق نه آهي، ڇاڪاڻ ته هن دريافت جي طريقي سان پيدا ٿيندڙ وکر تمام ٽاس (انسيٽ) ۾ ساڳئي چوٽي جي قيمت ڏيکاري ٿو.
ٻئي طرف، مضبوطيءَ جو امتحان گهڻو وڌيڪ برداشت ڪندڙ آهي، ساڳي طرح Cqs پيدا ڪري ٿو ٽاس جي وسيع رينج ۾، جيئن GFAP ٽيسٽ ۾ ڏيکاريل آهي P 6d ۾.
ساڳئي 8 درجا سينٽيگريڊ رينج ۾ حاصل ڪيل Cqs ۾ فرق 1 کان گهٽ آهي، ۽ تحلیل وکر (انسيٽ) هن درجه حرارت جي حد ۾ سڃاڻپ خاصيتن جي تصديق ڪري ٿو.اها ڳالهه نوٽ ڪرڻ جي قابل آهي ته ڳڻپيوڪر Tas ۽ حقيقي Ta جي حد بلڪل مختلف ٿي سگهي ٿي.
تحقيق ڪندڙن کي موثر پرائمر ڊزائين ڪرڻ ۾ مدد ڏيڻ لاءِ ڪيتريون ئي ھدايتون تيار ڪيون ويون آھن، جن مان گھڻا ڊگھي قائم ڪيل قاعدن تي ٻڌل آھن ۽ پرائمر جي 3′آخر تي گھڻو ڌيان ڏنو ويو آھي.اهو اڪثر ڪري 3 جي آخر ۾ هڪ G يا C ۽ ٻه G يا C بيس (GC ڪلمپ) شامل ڪرڻ جي سفارش ڪئي وئي آهي، پر آخري 5 بيس مان ٻن کان وڌيڪ نه.
عملي طور تي، اهي ضابطا محقق جي رهنمائي ڪري سگهن ٿا، پر اهي ضروري نه آهن ته سڀني حالتن ۾ درست هجن.
P7 |پرائمر جي 3′آخر ۾ خاصيت يا ڪارڪردگي تي ٿورو اثر پوي ٿو.
A. انساني HIF-1α (NM_181054.2) جين لاءِ پرائمر جي پوزيشن.
B. استعمال ڪريو Agilent Brilliant III SYBR گرين ماءُ شراب (Cat. No. 600882) ڇهن ٽيسٽ شين کي وڌائڻ لاءِ.
C. بائيو-ريڊ جي CFX qPCR اوزار ۽ 3′end پرائمر پاران رڪارڊ ڪيل ايمپليفڪيشن گراف ۽ پگھلڻ وارو وکر.NTCs ڳاڙهي ۾ ڏيکاريل آهن.
D. Cqs رڪارڊ هر ٽيسٽ آئٽم جو
مثال طور، P 7 ۾ نتيجو 3′ آخر قاعدي جي تضاد آهي.سڀئي ڊزائينون بنيادي طور تي ساڳيا نتيجا پيدا ڪن ٿيون، صرف ٻه پرائمر مجموعن سان NTC ۾ غير مخصوص ايمپليفڪيشن جي ڪري.
بهرحال، اسان GC ڪلپ جي اثر جي حمايت نٿا ڪري سگھون، ڇاڪاڻ ته هن صورت ۾، A يا T کي وڌ ۾ وڌ 30 بنيادي طور استعمال ڪرڻ سان خاصيت گهٽ نه ٿي ٿئي.
ٽيسٽ سي، جتي F پرائمر GGCC ۾ ختم ٿئي ٿو، NTCs ۾ Cqs کي رڪارڊ ڪيو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته ڪو شايد 30 جي آخر ۾ انهن تسلسل کان بچڻ چاهي ٿو.اسان زور ڀريو ٿا ته هڪ پرائمر جوڙي جي بهترين 3′آخر جي ترتيب کي طئي ڪرڻ جو واحد طريقو ڪجهه اميدوار پرائمر تجرباتي طور تي جائزو وٺڻ آهي.
وڌائڻ جي ڪارڪردگي
خاص طور تي، جيتوڻيڪ غير مخصوص پي سي آر جي چڪاس ڪڏهن به مخصوص نه ٿي سگهي ٿي، ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي کي ترتيب ڏئي سگهجي ٿو ۽ وڌائي سگهجي ٿو ڪيترن ئي مختلف طريقن سان اينزيم، ماء جي شراب، اضافو، ۽ سائيڪل جي حالتن کي تبديل ڪندي.
پي سي آر جي چڪاس جي ڪارڪردگي کي جانچڻ لاءِ، اهو بهتر آهي ته ٽارگيٽ نيوڪليڪ ايسڊ کان 10 يا 5 ڀيرا سيريل ڊيليوشن استعمال ڪيو وڃي، يعني ”معياري وکر جو طريقو“.
جيڪڏهن PCR amplicons يا مصنوعي ڊي اين اي ٽارگيٽ استعمال ڪيا وڃن ته هڪ معياري وکر پيدا ڪرڻ لاء، انهن مقصدن جي سيريل ڊيليوشن کي پس منظر جي ڊي اين اي جي مسلسل مقدار سان ملايو وڃي (جهڙوڪ جينومڪ ڊي اين اي).
P8 |پي سي آر جي ڪارڪردگي جو جائزو وٺڻ لاء گھٽائڻ وارو وکر.
A. استعمال ڪريو پرائمر HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ۽ R: TGTCCTGTGTGGTGACTTGTCC ۽ Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (catalog number 600882) PCR ۽ پگھلڻ واري وکر جي حالتن لاءِ.
B. 100 ng RNA کي ريورس ٽرانسڪرائب ڪيو ويو، 2 ڀيرا گھٽايو ويو، ۽ سيريل طور تي ٺھيل سي ڊي اين اي نموني کي 5 ڀيرا 1 اين جي انساني جينومڪ ڊي اين اي ۾ گھٽايو ويو.پگھلڻ وارو وکر انسٽ ۾ ڏيکاريل آهي.
C. ٻئين سي ڊي اين جي نموني لاء RT ردعمل، ٺهڪندڙ، ۽ سيريل ڊيلشن کي بار بار ڪيو ويو، ۽ نتيجا ساڳيا هئا.
P 8 ٻه معياري وکر ڏيکاري ٿو، ٻن مختلف سي ڊي اين اي نمونن تي ساڳيو ڳولڻ جو طريقو استعمال ڪندي، نتيجو ساڳيو ڪارڪردگي، اٽڪل 100٪، ۽ R2 قدر پڻ ساڳيو آهي، اهو آهي، تجرباتي ڊيٽا ۽ ريگريشن لائن جي وچ ۾ فٽ جو درجو يا ڊيٽا جي لڪيريت جي درجي.
ٻه معياري وکر برابر آهن، پر بلڪل ساڳيا نه آهن.جيڪڏهن مقصد مقصد جي صحيح مقدار کي طئي ڪرڻ آهي، اهو ياد رکڻ گهرجي ته غير يقيني صورتحال جي وضاحت ڪرڻ کان سواء ڪاپي نمبر جي حساب ڪتاب مهيا ڪرڻ ناقابل قبول آهي.
P9 |معياري وکر استعمال ڪندي مقدار سان لاڳاپيل ماپ جي غير يقيني صورتحال.
A. GAPDH (NM_002046) لاءِ پرائمر استعمال ڪريو PCR ۽ پگھلڻ واري وکر جي حالتن کي انجام ڏيڻ لاءِ.F: ACAGTTGCCATGTAGACC ۽ R: TAACTGGTTGAGCACAGG ۽ بايولائن جي سينسفسٽ SYBR ماسٽرمڪس (ڪيٽلاگ نمبر BIO-98050).
B. ايمپليفڪيشن چارٽ، پگھلڻ وارو وکر ۽ معياري وکر بايو ريڊ جي CFX qPCR اوزار سان رڪارڊ ٿيل.
C. معياري وکر گراف ۽ 95٪ اعتماد جو وقفو (CI).
D. نقلي نمبر ۽ 95٪ اعتماد جو وقفو ٽن Cq قدرن مان نڪتل آهي.
P 9 ڏيکاري ٿو ته هڪ بهتر ٽيسٽ لاءِ، هڪ معياري وکر جي موروثي تبديلي لڳ ڀڳ 2 ڀيرا آهي (95٪ اعتماد جو وقفو، گهٽ ۾ گهٽ وڌ کان وڌ)، جيڪو ٿي سگهي ٿو ننڍي ۾ ننڍي تبديلي جنهن جي توقع ڪري سگهجي.
لاڳاپيل پيداوار:
پوسٽ جو وقت: سيپٽمبر-30-2021
