هر ڪو qRT-PCR تجربي جي اصول، پرائمر ڊيزائن، نتيجن جي تشريح وغيره جي باري ۾ ڳالهائي رهيو آهي، پر منهنجو خيال آهي ته مون کي توهان سان qRT-PCR جي تجرباتي آپريشن کي حصيداري ڪرڻ گهرجي.اهو ننڍڙو آهي، پر اهو نتيجو آهي.
qRT-PCR ڪرڻ کان اڳ، اسان کي پنھنجي آر اين اي ۽ آپريشن جي طريقن کي واضح سمجھڻ گھرجي.آخرڪار، اسان جي ڪوششن جو مقصد صرف مشق ڪرڻ بدران نتيجا حاصل ڪرڻ آهي.تنهن ڪري qRT-PCR ڪرڻ کان اڳ، اسان کي هيٺين مسئلن کي طئي ڪرڻ جي ضرورت آهي (جن مان ڪجهه صرف SYBR تي لاڳو آهن).
1 ڇا توهان کي پڪ آهي ته توهان جو آر اين اي خراب نه ٿيو آهي؟
NanoDrop 2000 صرف آر اين اي جي ڪنسنٽريشن ۽ پاڪائي کي ڳولي سگهي ٿو، پر آر اين اي جي سالميت کي ڳولي نٿو سگهي.
RNA (RNA Intesity Number) قدر RNA جي سالميت کي عڪاسي ڪري سگھي ٿو، جيڪو Agilent 2100 Bioanalyzer سسٽم ذريعي معلوم ٿئي ٿو.
شڪل. مختلف آر اين اي نمونن لاءِ RIN قدرن جو اسڪيميٽڪ ڊراگرام (eukaryotes)
بهرحال، ليبارٽريز ۾ عام طور تي Agilent 2100 Bioanalyzer ڪونهي.ان صورت ۾، اسان formaldehyde جيل ذريعي ڳولي سگهون ٿا، پر آر اين اي جي ڪل مقدار جي گهرج وڌيڪ آهي، تنهنڪري تيز ترين طريقو عام جيل الیکٹروفورسس استعمال ڪرڻ آهي.اهو ضروري آهي ته نيوڪليز آزاد ماحول ۾ هجي، تنهنڪري اهو ضروري آهي ته اليڪٽرروفورس ٽينڪ، سول بوتل، جيل بریکٹ ۽ DEPC پاڻي سان ڪنگڻ.اگروز پڻ نيوڪليز کان پاڪ آهي (جيستائين اهو تازو کوليو وڃي) ۽ لوڊنگ بفر کي جيترو ٿي سگهي تازو کوليو وڃي، 1.2٪ جيل سان.
ياد رهي ته جيل کي مڪمل طور تي ڦهلائڻ گهرجي، ٻي صورت ۾ اهو غير معمولي بينڊن جو سبب بڻجندو، جيئن شڪل ۾ نموني 9 ۾ ڏيکاريل آهي.جيڪڏهن وولٽيج تمام گهڻي آهي يا گهڻي وقت تائين هلندي ته گرمي پيدا ڪندي ۽ آر اين اي جي تباهيءَ جو سبب بڻجندي، تنهن ڪري وولٽيج ۽ وقت کي مناسب ڪنٽرول ڪرڻ گهرجي.ان کان علاوه، جيل رننگ پڻ وڌيڪ طئي ڪري سگھي ٿو ته ڇا نموني ۾ ڊي اين اي جي باقي بچيل آهي، ۽ اهو مشاهدو ڪيو ته ڇا ڊسپينسنگ کوهه ۾ وڏي تعداد ۾ رکيل بينڊ موجود آهن.
شڪل.جيل اليڪٽرروفورسس آر اين اي جو پتو لڳائڻ
2 ڇا توهان پڪ آهيو ته توهان جي سي ڊي اين جي ڪنسنٽريشن بابت؟
ليبارٽري ۾ وڏن ڀينرن جو تجربو اهو آهي ته 20 ul سسٽم جي سي ڊي اين اي کي هر هڪ انسائيڪشن ذريعي سڌو سنئون 20X ملائي ويندي آهي، جڏهن ته پوسٽ ڊاڪٽري ڀينرن کي 10X ملائي ويندي آهي.مان اڪثر حالتن تي ڀاڙيندو آهيان.ڇاڪاڻ ته هر شخص پاران ذڪر ڪيل آر اين اي جي معيار مختلف آهي، ريورس جي سطح پڻ مختلف آهي، ۽ ريورسل ٽيڪنالاجي مستحڪم نه ٿي سگهي ٿي.
تنهن ڪري جڏهن به مون کي ريورس ٿيل سي ڊي اين اي حاصل ٿيندو، آئون پهريان ان کي اٽڪل 3 ڀيرا گهٽائيندس، ۽ پوءِ RT-PCR ڪرڻ لاءِ گھر جي سنڀاليندڙ جين کي استعمال ڪندي، سائيڪلن جو تعداد عام طور تي 25 چڪر هوندو آهي، مخصوص ڪنسنٽريشن کي سڃاڻڻ لاءِ، ۽ پوءِ آخري ڊيليشن فيڪٽر کي طئي ڪرڻ لاءِ.
3 ڇا توهان کي پڪ آهي ته توهان جا پرائمر استعمال ڪرڻ آسان آهن؟
اهو qRT-PCR جي پگھلڻ واري وکر کي پاس ڪري سگهي ٿو، پر اهو اڃا تائين پئسا خرچ ڪري ٿو.ليبارٽرين لاءِ جن کي تمام گهڻو پئسو نه هوندو، جڏهن انهن کي تمام گهڻا پرائمر ملندا آهن، اهي عام RT-PCR استعمال ڪري سگهن ٿا ته اهو ڏسڻ لاءِ ته ڇا اهو هڪ واحد بينڊ آهي ۽ پرائمر جي خاصيت کي سڃاڻڻ لاءِ.جيڪڏهن ليبارٽري پئسن جي گھٽتائي نه آهي، سڀني پرائمر جي خاصيت هڪ ڀيرو پگھلڻ واري وکر ذريعي سڃاڻي سگهجي ٿي.
4 ڇا توهان کي پڪ آهي ته توهان جون تجرباتي حالتون موزون آهن؟
SYBR کي مضبوط روشنيءَ کان محفوظ رکڻ گھرجي، تنھنڪري SYBR ريجنٽ کي شامل ڪرڻ وقت اوور ھيڊ لائٽ کي بند ڪرڻ جي ڪوشش ڪريو، ۽ ان کي مڪمل ڪرڻ لاءِ صرف مدھم روشني استعمال ڪرڻ جي ضرورت آھي.
اسٽور SYBR 4 ° C تي.استعمال ۾ ھجڻ مھل، جھاگ کان بچڻ لاءِ چڱيءَ طرح ملائڻ لاءِ آسانيءَ سان مٿي ۽ ھيٺ ڦيرايو، ۽ زور سان نه گھمايو.
ڪجهه ننڍيون ڀينرون پي سي آر بورڊ تي مارڪون ڪڍڻ پسند ڪن ٿيون، ڇاڪاڻ ته نمونن کي گڏ ڪرڻ جي خوف کان، جيڪو غلط آهي.ڇاڪاڻ ته توهان جا نشان فلورسنٽ سگنلن جي مجموعن تي اثرانداز ٿيڻ جو تمام گهڻو امڪان آهن، آئون عام طور تي جونيئرز کي سفارش ڪريان ٿو ته تجرباتي نوٽ بڪ استعمال ڪرڻ لاءِ ياداشت ۾ مدد لاءِ، جيئن هيٺ ڏيکاريل آهي.
شڪل.qRT-PCR نموني لوڊنگ ڊراگرام
5 ڇا توهان کي پڪ آهي ته توهان اهو صحيح ڪري رهيا آهيو؟
پڪ ڪريو ته دستانو پائڻ، دستانو پائڻ، دستانو پائڻ، ۽ ضروري شيون ٽي دفعا چئو.
روشنيءَ ۾ SYBR جي نمائش کي گھٽائڻ لاءِ، مان ذاتي طور تي پھرين ھڪڙي ٽيمپليٽ شامل ڪرڻ پسند ڪريان ٿو، جيئن ھيٺ ڏنل شڪل ۾ ڏيکاريل آھي.تجربي جي مطابق، ٽيمپليٽ جي ٿوري مقدار جو اضافو نموني جي غلطين جو سبب بڻجڻ جو امڪان آهي.تنهن ڪري، ٽيمپليٽ جي ٿوري مقدار کي شامل ڪرڻ جي ڪري پيدا ٿيل غلطي کي گھٽائڻ لاء، آئون عام طور تي نموني کي ٻيڻو ڪري ٿو، ۽ مقدار کي ٻيڻو ڪري ٿو جڏهن نموني شامل ڪريان ٿو ته H2O2 جي مقدار کي گھٽائڻ لاء.
شڪل.qRT-PCR لوڊشيڊنگ جو اسڪيميٽ ڊراگرام
پوءِ ترتيب ڏيو qRT-PCR سسٽم ھيٺ ڏنل.
شڪل.qRT-PCR سسٽم تيار ڪرڻ جو خاڪو
نوٽ: ترتيب ڏيڻ جي عمل کي برف تي ٿيڻ جي ضرورت آهي.
نموني شامل ڪرڻ کان پوء، شفاف سيلنگ فلم پيسٽ ڪريو.ڪوشش ڪريو پنھنجي ھٿن سان شفاف سيلنگ فلم جي مٿاڇري کي ھٿ نه ڪريو، رڳو فلم جي ٻنهي پاسن کان خلا کان ڪم ڪريو.ڇاڪاڻ ته آڱرين جا نشان شايد فلورسنٽ سگنلن جي جمع کي متاثر ڪري سگھن ٿا.پوءِ 10 سيڪنڊن لاءِ تيز رفتار سينٽرفيوج ڪرڻ لاءِ سينٽرفيوج استعمال ڪريو ته جيئن نموني کي ڀت تي لٽڪڻ کان روڪيو وڃي.
لاڳاپيل مصنوعات:
پوسٽ جو وقت: اپريل-28-2023
