ريئل ٽائيم پي سي آر، جيڪو مقداري پي سي آر يا qPCR جي نالي سان پڻ سڃاتو وڃي ٿو، هڪ طريقو آهي حقيقي وقت جي نگراني ۽ تجزيو لاءِ پي سي آر ايمپليفڪيشن پروڊڪٽس.
ڇاڪاڻ ته مقداري پي سي آر ۾ سادي آپريشن، تيز ۽ آسان، اعليٰ حساسيت، سٺي ريپٽيبلٽي، ۽ گهٽ آلودگي جي شرح جا فائدا آهن، ان کي وڏي پيماني تي طبي جانچ، دوا جي افاديت جي تشخيص، جين اظهار جي تحقيق، ٽرانسجنڪ ريسرچ، جين جي سڃاڻپ، پيٿوجن جي سڃاڻپ، جانورن ۽ ٻوٽن جي چڪاس ۾ استعمال ڪيو ويندو آهي.، کاڌي جي جاچ ۽ ٻيا شعبا.
تنهن ڪري، ڇا توهان لائف سائنسز ۾ بنيادي تحقيق ۾ مصروف آهيو، يا دواسازي ڪمپنين جا ملازم، جانورن جي پالڻ واريون ڪمپنيون، فوڊ ڪمپنيون، يا ايستائين جو داخلا-ايگزٽ انسپيڪشن ۽ قرنطينه بيوروز، ماحولياتي نگراني کاتي، اسپتالن ۽ ٻين يونٽن جا ملازم، توهان کي گهٽ يا گهٽ وڌ ۾ وڌ بي نقاب ٿيندو يا توهان کي پي سي آر جي مقدار جي ماهر ڪرڻ جي ڄاڻ جي ضرورت پوندي.

اصل وقت PCR جو اصول

ريئل ٽائيم پي سي آر هڪ طريقو آهي جنهن ۾ فلورسنٽ مواد شامل ڪيا ويندا آهن پي سي آر رد عمل واري نظام ۾، ۽ پي سي آر جي رد عمل جي عمل ۾ فلورسنس سگنل جي شدت کي حقيقي وقت ۾ مقداري پي سي آر اوزار ذريعي مانيٽر ڪيو ويندو آهي، ۽ آخرڪار تجرباتي ڊيٽا جو تجزيو ۽ پروسيس ڪيو ويندو آهي.

【وڌائڻ وارو وکر】اهو وکر آهي جيڪو PCR جي متحرڪ عمل کي بيان ڪري ٿو.PCR جو amplification وکر اصل ۾ معياري exponential curve نه آهي، پر هڪ سگمائيڊ وکر آهي.

[Amplification وکر جو پليٽ فارم مرحلو]PCR سائيڪلن جي تعداد جي وڌڻ سان، ڊي اين اي پوليميرس جي غير فعال ٿيڻ، ڊي اين ٽي پيز ۽ پرائمر جي گھٽتائي، ۽ پراڊڪٽ جي رد عمل جي ذريعي ٺهڪندڙ رد عمل جي روڪٿام، pyrophosphate وغيره، PCR هميشه تيزيء سان نه وڌندو آهي.، ۽ آخرڪار هڪ پليٽ ۾ داخل ٿيندو.

[تفصيلي ترقي وارو علائقو امپليڪشن وکر جو]جيتوڻيڪ پليٽي جو مرحلو تمام گهڻو مختلف هوندو آهي، هڪ مخصوص علائقي ۾ امپليفڪيشن وکر جي تيزيءَ واري ترقي واري علائقي ۾، ورجائي قابليت تمام سٺي آهي، جيڪا PCR جي مقداري تجزيي لاءِ تمام ضروري آهي.

[درج جو قدر ۽ Ct قدر]اسان fluorescence معلوم ڪرڻ جي حد قدر مقرر ڪريون ٿا مناسب پوزيشن تي ايمپليفڪيشن وکر جي تيز رفتار ترقي واري علائقي ۾، يعني حد جي قيمت (Threshold).حد جي قيمت جو چونڪ ۽ ايمپليفڪيشن وکر Ct قدر آهي، اهو آهي، Ct قدر چڪر جي تعداد ڏانهن اشارو ڪري ٿو (Threshold Cycle) جڏهن حد جي قيمت پهچي وڃي ٿي.

هيٺ ڏنل گراف واضح طور تي حد جي قطار ۽ ايمپليفڪيشن وکر، حد ۽ Ct قدر جي وچ ۾ تعلق ڏيکاري ٿو.

【ڪيئن quantify ڪرڻ لاء؟】

اهو رياضياتي نظريي جي ذريعي ثابت ڪيو ويو آهي ته Ct قدر جو شروعاتي ٽيمپليٽس جي تعداد جي لاگارٿم سان هڪ انوورس لڪير تعلق آهي.ريئل ٽائيم پي سي آر اصل وقت ۾ پي سي آر ايمپليفڪيشن پراڊڪٽس کي مانيٽر ڪري ٿو ۽ انهن جي مقدار کي تيزيءَ واري ايمپليفڪيشن مرحلي دوران بيان ڪري ٿو.

PCR جي هر چڪر لاءِ، ڊي اين اي تيزيءَ سان 2 ڀيرا وڌيو، ۽ جلد ئي سطح تي پهچي ويو.

فرض ڪيو ته شروعاتي ڊي اين اي جو مقدار A آهي₀ n cycles کان پوء، DNA پيداوار جي نظرياتي مقدار کي بيان ڪري سگهجي ٿو:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

پوءِ، جيترو وڌيڪ ابتدائي ڊي اين اي جي رقم A 0 آهي، اوترو ئي تيزيءَ سان وڌيل پراڊڪٽ جي مقدار معلوم ڪرڻ واري قيمت An تائين پهچندي آهي، ۽ جڏهن An تائين پهچندي آهي ته چڪر جو تعداد Ct قدر هوندو آهي.اھو آھي، جيترو وڌيڪ ابتدائي DNA مقدار A 0 آھي، اوترو پھريائين ايمپليفڪيشن وکر جي چوٽي آھي، ۽ ساڳيءَ ريت گھربل تعداد n جي چڪرن ۾ گھٽ آھي.

اسان سڃاتل ڪنسنٽريشن جي معيار کي گريڊئينٽ ڊيليوشن ڪريون ٿا ۽ ان کي ريئل ٽائيم پي سي آر لاءِ ٽيمپليٽ طور استعمال ڪريون ٿا، ۽ ڊي اين اي جي رقم کي وڌيڪ کان گھٽ شروع ڪرڻ جي ترتيب ۾ برابر وقفن تي ايمپليفڪيشن وکر جو سلسلو حاصل ڪيو ويندو.Ct قدر ۽ شروعاتي ٽيمپليٽس جي تعداد جي لاگارٿم جي وچ ۾ لڪير واري رشتي جي مطابق، a[معياري وکر] ٺاهي سگھجي ٿو.

معياري وکر ۾ اڻڄاتل ڪنسنٽريشن سان نموني جي Ct قدر کي متبادل ڪرڻ سان، اڻڄاتل ڪنسنٽريشن سان نموني جي شروعاتي ٽيمپليٽ رقم حاصل ڪري سگهجي ٿي، جيڪو حقيقي وقت PCR جو مقداري اصول آهي.

ريئل ٽائيم پي سي آر جو پتو لڳائڻ جو طريقو

ريئل ٽائيم پي سي آر پي سي آر ايمپليفڪيشن پراڊڪٽس کي ڳولي ٿو رد عمل واري نظام ۾ فلورسنس جي شدت کي معلوم ڪندي.

فلورسنٽ ڊائي ايمبيڊنگ جو اصول】

فلورسنٽ رنگجيئن ته ٽي بي گرين ®، پي سي آر سسٽم ۾ ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي کي غير خاص طور تي پابند ڪري سگھن ٿا ۽ پابند ٿيڻ تي فلوروس.

ردعمل سسٽم ۾ فلورسنس جي شدت تيزيء سان وڌي وئي PCR سائيڪل جي واڌ سان.فلورسنس جي شدت کي ڳولڻ سان، رد عمل واري نظام ۾ ڊي اين اي ايمپليفڪيشن جي مقدار کي حقيقي وقت ۾ مانيٽر ڪري سگهجي ٿو، ۽ پوء نموني ۾ شروع ٿيندڙ ٽيمپليٽ جي مقدار جو اندازو لڳائي سگهجي ٿو.

【فلورسنٽ تحقيق جو اصول】

فلورسنٽ جاچ5′ جي آخر ۾ فلوروسنٽ گروپ ۽ 3′ آخر ۾ هڪ quenching گروپ سان گڏ هڪ نيوڪليڪ ايسڊ تسلسل آهي، جيڪو خاص طور تي ٽيمپليٽ سان پابند ٿي سگهي ٿو.جڏهن پروب برقرار آهي، فلوروفور طرفان خارج ٿيل فلوروسنس کي ٻرندڙ گروپ طرفان ختم ڪيو ويندو آهي ۽ فلورس نه ٿي سگهي.جڏهن تحقيق ختم ٿي ويندي آهي، فلورسنٽ مادو الڳ ٿي ويندو ۽ فلورسنس خارج ڪندو.

هڪ فلورسنٽ جاچ شامل ڪئي وئي آهي PCR ردعمل حل ۾.annealing جي عمل دوران، fluorescent جاچ ٽيمپليٽ جي مخصوص پوزيشن کي پابند ڪندو.توسيع جي عمل دوران، PCR اينزائم جي 5′→3′ Exonuclease سرگرمي سان ٺهيل فلورسنٽ پروب کي ٽوڙي سگهي ٿي، ۽ فلورسنٽ مادو فلورسنس کي خارج ڪرڻ لاءِ الڳ ٿي ويو آهي.رد عمل جي نظام ۾ تحقيق جي فلورسنس جي شدت کي ڳولڻ سان، پي سي آر جي پيداوار جي امپلائيشن مقدار جي نگراني ڪرڻ جو مقصد حاصل ڪري سگهجي ٿو.

【فلورسنس ڳولڻ جو طريقو چونڊيو】

جيڪڏهن اهو استعمال ڪيو وڃي ٿو ترتيبن کي اعليٰ هومولوجي سان فرق ڪرڻ ۽ ملٽي پلڪس پي سي آر جي چڪاس ڪرڻ جهڙوڪ SNP ٽائپنگ تجزيو، فلورسنٽ پروب جو طريقو ناقابل بدلي آهي.
ٻين حقيقي وقت PCR تجربن لاء، هڪ سادي، آسان ۽ گهٽ قيمت فلورسنٽ چميرا طريقو استعمال ڪري سگهجي ٿو.

تحقيق مضبوط خاصيت، ملٽي پلڪس پي سي آر جي قابل

گھٽتائي

amplification لاء اعلي specificity گهرجون؛

ملٽي پلڪس پي سي آر ڪم نه ٿو ڪري سگھجي مخصوص پروب ڊزائين ڪرڻ جي ضرورت آهي، وڏي قيمت؛

ڪڏهن ڪڏهن تحقيق جي جوڙجڪ ڏکيو آهي

لاڳاپيل مصنوعات: