qPCR تجربن ۾، پرائمر ڊيزائن پڻ هڪ اهم ڪڙي آهي.ڇا پرائمر مناسب آهن يا نه، ويجهي سان لاڳاپيل آهي ته ڇا ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي معيار تائين پهچي ٿي، ڇا پروڊڪٽس مخصوص آهن، ۽ ڇا تجرباتي نتيجا موجود آهن.
پوءِ qPCR پرائمر جي خاصيت کي ڪيئن بهتر بڻايو وڃي؟اعلي amplification ڪارڪردگي؟
اڄ، اسين توهان کي گڏ ڪنداسين qPCR پرائمر ڊزائين ڪرڻ لاءِ، ۽ ڏيون ٿا qPCR پرائمر ڊيزائن کي تجربن ۾ هڪ ڪارائتو علم وارو مهارت.
جڏهن qPCR پرائمر ٺاھڻ وقت، عام طور تي ھيٺين نقطن تي ڌيان ڏيو: پرائمر جيترو ممڪن ٿي سگھي انٽرن تي ٺاھيو وڃي، پراڊڪٽ جي ڊگھائي 100-300 bp ھئڻ گھرجي، Tm ويليو جيترو ٿي سگھي 60°C جي ويجھو ھجڻ گھرجي، ۽ upstream ۽ downstream پرائمر جيترو ٿي سگھي ويجھو ھجن، ۽ پرائمر جي پڇاڙي G يا C ھجي، وغيره انتظار ڪريو.
1. پرائمر جي ڊيزائن جو اندريون اسپننگ
جڏهن qPCR پرائمر ڊزائين ڪري رهيا آهن، پرائمر چونڊيندا آهن جيڪي اندروني طور تي ڊزائين ڪيل آهن GDNA ٽيمپليٽ کي وڌائڻ کان روڪيو وڃي ٿو، ۽ پروڊڪٽس سڀ سي ڊي اين اي جي ايمپليفڪيشن مان نڪتل آهن، اهڙيء طرح gDNA آلودگي جي اثر کي ختم ڪري ٿي.
2. پرائمر ڊگھائي
پرائمر جي ڊيگهه عام طور تي 18-30 NT جي وچ ۾ آهي، ۽ ايمپليفڪيشن جي پيداوار جي ڊيگهه کي 100-300 bp جي وچ ۾ ڪنٽرول ڪيو وڃي جيترو ممڪن آهي.
جيڪڏهن پرائمر تمام ننڍو آهي، ته اهو غير مخصوص واڌارو ٿيندو، ۽ جيڪڏهن اهو تمام ڊگهو آهي، اهو آسانيء سان ثانوي ساخت (جهڙوڪ وار پنن جي جوڙجڪ) ٺاهيندو.جيڪڏهن ايمپليفڪيشن پراڊڪٽ تمام ڊگهو آهي، اهو پوليميرس جي رد عمل لاءِ مناسب ناهي، جيڪو پي سي آر امپليڪشن جي ڪارڪردگي کي متاثر ڪندو.
3. GC مواد ۽ Tm قدر
پرائمر جي GC مواد کي 40٪ ۽ 60٪ جي وچ ۾ ڪنٽرول ڪيو وڃي.جيڪڏهن اهو تمام گهڻو يا تمام گهٽ آهي، اهو رد عمل شروع ڪرڻ لاء موزون ناهي.اڳيون ۽ ريورس پرائمر جي GC مواد ساڳئي Tm قدر ۽ annealing گرمي پد حاصل ڪرڻ لاء هڪ ئي ويجهو هجڻ گهرجي.
Tm ويليو 55-65 °C جي وچ ۾ هجڻ گهرجي جيترو ممڪن آهي، عام طور تي 60 ° C جي چوڌاري، ۽ Tm جو قدر جيترو ممڪن ٿي سگهي ويجهو هجڻ گهرجي، ترجيحي طور تي 4 ° C کان وڌيڪ نه.
4. پرائمر جي 3′ آخر ۾ A کي چونڊڻ کان پاسو ڪريو
جڏهن پرائمر جي 3′ پڇاڙي بي ترتيب آهي، اتي مختلف بنيادن جي جوڙجڪ ڪارڪردگي ۾ وڏو فرق آهي.جڏهن آخري بنياد A آهي، اهو پڻ زنجير جي جوڙجڪ کي شروع ڪري سگهي ٿو جيتوڻيڪ بي ميلاپ جي صورت ۾، ۽ جڏهن آخري بنياد آهي T جڏهن، بي ميل انڊڪشن جي ڪارڪردگي تمام گهٽجي ويندي آهي.تنهن ڪري، پرائمر جي 3′ آخر ۾ A کي چونڊڻ کان بچڻ جي ڪوشش ڪريو، ۽ اهو بهتر آهي ته T چونڊيو وڃي.
جيڪڏهن اهو هڪ پروب پرائمر آهي، ته تحقيق جي 5′ پڇاڙي G نه ٿي سگهي، ڇاڪاڻ ته جڏهن هڪ واحد G بيس FAM فلورسنٽ رپورٽر گروپ سان ڳنڍيل آهي، G پڻ FAM گروپ پاران خارج ٿيل فلورسنٽ سگنل کي ختم ڪري سگهي ٿو، نتيجي ۾ غلط منفي نتيجا.ظاهر ٿيڻ.
5. بنيادي تقسيم
پرائمر ۾ چار بيسز جي ورڇ ترجيحي طور تي بي ترتيب آھي، 3 کان وڌيڪ لڳاتار G يا C کان پاسو ڪيو وڃي 3′ آخر ۾، ۽ 3 کان وڌيڪ لڳاتارG يا C GC-rich sequence علائقي ۾ جوڙ ٺاهڻ آسان آهن.
6. پرائمر ڊيزائن واري علائقي کي پيچيده ثانوي جوڙجڪ کان بچڻ گهرجي.
ثانوي ڍانچي جو ٺهيل واحد اسٽينڊ امپليفڪيشن پراڊڪٽ جي پي سي آر جي هموار ترقي کي متاثر ڪندو.اڳڪٿي ڪندي ته ڇا ھدف جي ترتيب ۾ ثانوي ڍانچي اڳ ۾ آھي، ڪوشش ڪريو ھن علائقي کي پرائمر جي ڊيزائن ۾ کان بچڻ جي.
7. پرائمر پاڻ کي ۽ پرائمر جي وچ ۾ لڳاتار مڪمل ڪندڙ بنيادن کان بچڻ جي ڪوشش ڪرڻ گهرجي.
پرائمر پاڻ ۽ پرائمر جي وچ ۾ ڪا به لڳاتار 4 بنيادي مڪمل نه ٿي سگھي.پرائمر کي پاڻ ۾ هڪ مڪمل تسلسل نه هجڻ گهرجي، ٻي صورت ۾ اهو پاڻ کي هڪ بال جي پنن جي جوڙجڪ ٺاهيندو، جيڪو پرائمر ۽ ٽيمپليٽ جي اينيلنگ ميلاپ کي متاثر ڪندو.
اپ اسٽريم ۽ لانڊ اسٽريم پرائمر جي وچ ۾ ڪمپليمينٽري تسلسل موجود نه هوندا آهن.پرائمر جي وچ ۾ مڪمليت پرائمر ڊيمرز پيدا ڪندو، جيڪو پي سي آر جي ڪارڪردگي کي گھٽائيندو ۽ مقدار جي درستگي کي به متاثر ڪندو.جيڪڏهن پرائمر-ڊائمر ۽ هيئرپن جي جوڙجڪ ناگزير آهن، △G جي قيمت تمام گهڻي نه هجڻ گهرجي (4.5 kcal/mol کان گهٽ هجڻ گهرجي).
8. پرائمر ٽارگيٽ مخصوص پراڊڪٽ کي وڌايو.
qPCR جي ڳولا جو حتمي مقصد ٽارگيٽ جين جي گهڻائي کي سمجهڻ آهي.جيڪڏهن غير مخصوص واڌارو ٿئي ٿي، مقدار درست نه ٿيندي.تنهن ڪري، پرائمر ڊزائين ڪرڻ کان پوء، انهن کي BLAST پاران آزمائشي ٿيڻ جي ضرورت آهي، ۽ مصنوعات جي خاصيت کي ترتيب واري ڊيٽابيس ۾ مقابلو ڪيو ويو آهي.
اڳيون، اسان انساني GAS6 (ترقي جي گرفتاري مخصوص 6) جين کي مثال طور qPCR پرائمر ڊزائين ڪرڻ لاءِ وٺون ٿا.
01 سوال جين
هومو GAS6NCBI ذريعي.هتي، اسان کي جين جي نالي ۽ نسلن جي مقابلي تي ڌيان ڏيڻ گهرجي انهي کي يقيني بڻائڻ ته اهي مطابقت آهن.
02 جين جي ترتيب ڳوليو
(1) جيڪڏهن ٽارگيٽ جي ترتيب جينومڪ ڊي اين اي آهي، پهرين هڪ کي چونڊيو، جيڪو جين جو جينومڪ ڊي اين اي تسلسل آهي.
(2) جيڪڏھن ھدف جي ترتيب mRNA آھي، ٻيو چونڊيو.داخل ٿيڻ کان پوء، هيٺ ڏنل جدول ۾ "CDS" تي ڪلڪ ڪريو.ناسي پس منظر جي ترتيب جين جي ڪوڊنگ تسلسل آهي.
03 ڊزائين پرائمر
Primer-BLAST انٽرفيس داخل ڪريو
مٿي کاٻي پاسي فاسٽا فارميٽ ۾ جيني ترتيب نمبر يا ترتيب داخل ڪريو، ۽ لاڳاپيل پيرا ميٽرز ڀريو.

"پرائمر حاصل ڪريو" تي ڪلڪ ڪريو ۽ NCBI توهان کي ٻڌائڻ لاءِ پاپ اپ ٿيندو ته اهڙي پيٽرولر جي چونڊ کي ٻين ڌار ڌار مختلف قسمن ڏانهن وڌايو ويندو.اسان چيڪ ڪري سگھون ٿا مختلف ورهائڻ واري مختلف قسمن کي ۽ انهن کي جمع ڪري سگهون ٿا مناسب پرائمر جوڙو حاصل ڪرڻ لاءِ (جيئن هيٺ ڏنل شڪل ۾ ڏيکاريل آهي).اهو عمل شايد ڏهن سيڪنڊن کي هلائڻ لاءِ.
انهن پرائمر جوڑوں جو annealing گرمي پد 60 ° C جي چوڌاري آهي.تجربي جي مقصد جي مطابق، پرائمر کي وچولي ڊگھي، سٺي خاصيت ۽ تجربي لاءِ پرائمر جي گھٽ خود مڪمل ڪرڻ سان چونڊيو، ۽ ڪاميابي جي شرح ڪافي بلند آھي!
04 پرائمر خاصيت جي تصديق
حقيقت ۾، پرائمر ڊزائين ڪرڻ کان علاوه، پرائمر-بلاسٽ پڻ پرائمر جو جائزو وٺي سگھي ٿو جيڪي اسان پاڻ ٺاھيو آھي.پرائمر ڊيزائن واري صفحي تي واپس وڃو، اپ اسٽريم ۽ ڊائون اسٽريم پرائمر داخل ڪريو جيڪي اسان ٺاھيا آھن، ۽ ٻيا پيرا ميٽر ترتيب نه ڏنا ويندا.جمع ڪرڻ کان پوء، توهان ڏسي سگهو ٿا ته ڇا پرائمر جو جوڙو ٻين جين تي پڻ موجود آهي.جيڪڏهن اهي سڀئي جين تي ڏيکاريا وڃن ٿا جنهن کي اسين وڌائڻ چاهيون ٿا، ظاهر ڪري ٿو ته هن پرائمر جي جوڙي جي خاصيت عظيم آهي!(مثال طور، اهو صرف پرائمر سوال جو نتيجو آهي!)

05 پرائمري معيار جو فيصلو
ڪهڙي قسم جو پرائمر آهي ”مڪمل“ پرائمر جيڪو گڏ ڪري ٿو ”امپليفڪيشن ڪارڪردگيءَ کي معيار تائين“، ”ايمپليفائيڊ پراڊڪٽ جون خاصيتون“، ۽ ”قابل اعتماد تجرباتي نتيجا“؟
وڌائڻ جي ڪارڪردگي

پگھلڻ وارو وکر
پرائمر جي ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي 90٪ -110٪ تائين پهچندي آهي، جنهن جو مطلب آهي ته ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي سٺي آهي، ۽ پگھلڻ واري وکر جي هڪ چوٽي آهي ۽ عام طور تي Tm> 80 ° C، جنهن جو مطلب آهي ته ايمپليفڪيشن جي خاصيت سٺي آهي.
 
لاڳاپيل مصنوعات:
ريئل ٽائيم پي سي آر آسان- SYBR GREEN I
حقيقي وقت پي سي آر آسان-تقمان