پرائمر ڊيزائن جي بنياد (99٪ مسئلا حل ٿي سگهن ٿا)
1. پرائمر ڊگھائي: درسي ڪتاب کي 15-30bp جي ضرورت آھي، عام طور تي اٽڪل 20bp.اصل حالت 18-24bp هجڻ بهتر آهي ته خاصيت کي يقيني بڻائڻ لاءِ، پر جيترو ڊگهو هوندو اوترو ڊگهو پرائمر به خاصيت کي گهٽائيندو، ۽ پيداوار کي گهٽائيندو.
2. پرائمر ايمپليفڪيشن اسپن: 200-500bp مناسب آهي، ۽ ٽڪڙي کي مخصوص حالتن ۾ 10kb تائين وڌائي سگھجي ٿو.
3. پرائمر بيس: G+C جو مواد 40-60% هجڻ گهرجي، تمام ٿورو G+C امپليفڪيشن اثر سٺو ناهي، تمام گهڻو G+C غير مخصوص بينڊ ظاهر ڪرڻ آسان آهي.ATGC بهترين طور تي ورهايل آهي، 5 کان وڌيڪ purine يا pyrimidine nucleotides جي ڪلستر کان بچڻ.استحڪام کي وڌائڻ لاءِ 5′ آخر ۽ وچ واري ترتيب لاءِ ملٽي-gc، 3′ آخر ۾ امير GC کان پاسو ڪريو، آخري 3 بيسز لاءِ ڪو GC نه، يا آخري 5 مان 3 بيسز لاءِ ڪو به GC نه.
4. پرائمر ۾ ثانوي ڍانچي کان پاسو ڪريو، ۽ ٻن پرائمر جي وچ ۾ مڪمل ٿيڻ کان پاسو ڪريو، خاص طور تي 3 جي آخر ۾ مڪمل ڪرڻ، ٻي صورت ۾ پرائمر ڊائمر ٺھي ويندا ۽ غير مخصوص ايمپليفائيڊ بينڊ ٺاهيا ويندا.
5. پرائمر جي 3 جي پڇاڙيءَ ۾ بيسز، خاص ڪري آخري ۽ پڇاڙيءَ واري بيسز کي سختي سان جوڙڻ گھرجي ته جيئن پي سي آر جي ناڪاميءَ کان بچڻ لاءِ اڻ جڙيل ٽرمينل بيسز جي ڪري.
6. پرائمر کي مناسب ڪليويج سائيٽن سان شامل ڪري سگھجي ٿو، ۽ وڌايل ٽارگيٽ جي ترتيب کي ترجيحي طور تي مناسب ڪليويج سائيٽون ھجڻ گھرجي، جيڪا ڪليويج جي تجزيي يا ماليڪيولر ڪلوننگ لاءِ تمام گھڻي فائديمند آھي.
7. پرائمر جي خصوصيت: پرائمر کي نيوڪليڪ ايسڊ جي ترتيب واري ڊيٽابيس ۾ ٻين ترتيبن سان ڪو به واضح هومولوجي نه هجڻ گهرجي.
8. سافٽ ويئر استعمال ڪرڻ سکو: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (هي آن لائن ڊزائين بھترين ڪم ڪري ٿي).
مٿي ڏنل مواد گهٽ ۾ گهٽ 99٪ پرائمر ڊيزائن جي مسئلن کي حل ڪري سگهي ٿو.
پرائمر ڊيزائن جي تفصيل کي سنڀاليو
1. پرائمر ڊگھائي
عام پرائمر جي ڊيگهه 18 ~ 30 بيز آهي.عام طور تي، پرائمر جي اينيلنگ جي درجه حرارت کي طئي ڪرڻ لاء سڀ کان اهم عنصر پرائمر جي ڊيگهه آهي.پرائمر جي annealing گرمي پد عام طور تي چونڊيو ويندو آهي (Tm قدر -5 ℃)، ۽ ڪجهه سڌو سنئون استعمال Tm قدر.ھيٺ ڏنل فارمولن کي استعمال ڪري سگھجي ٿو تقريباً پرائمر جي annealing گرمي پد جي حساب سان.
جڏهن پرائمر جي ڊيگهه 20bp کان گهٽ هجي: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
جڏهن پرائمر جي ڊيگهه 20bp کان وڌيڪ آهي: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/ڊگھائي-5℃
ان کان علاوه، ڪيترائي سافٽ ويئر پڻ استعمال ڪري سگھجن ٿيون annealing جي درجه حرارت کي ڳڻڻ لاء، حساب ڪتاب جو اصول مختلف ٿيندو، تنهنڪري ڪڏهن ڪڏهن ڳڻپيوڪر قدر ۾ ننڍڙو خال ٿي سگھي ٿو.پي سي آر جي رد عمل کي بهتر ڪرڻ لاءِ، مختصر ترين پرائمر جيڪي 54 ℃ کان گهٽ نه هجڻ جي گرمي پد کي يقيني بڻائين ٿا، بهترين ڪارڪردگي ۽ خاصيت لاءِ استعمال ڪيا وڃن ٿا.
مجموعي طور تي، پرائمر جي خصوصيت هر اضافي نيوڪليوٽائيڊ لاءِ چار جي فيڪٽر سان وڌي ٿي، تنهنڪري اڪثر ايپليڪيشنن لاءِ پرائمر جي گھٽ ۾ گھٽ ڊيگهه 18 نيوڪليوٽائيڊس آهي.پرائمر جي ڊيگهه جي مٿين حد تمام ضروري ناهي، خاص طور تي رد عمل جي ڪارڪردگي سان لاڳاپيل.اينٽراپي جي ڪري، پرائمر جيترو ڊگهو هوندو، اوترو ئي گهٽ شرح جنهن تي اهو ٽارگيٽ ڊي اين اي سان ڳنڍڻ جي لاءِ ڳنڍيندو آهي ته جيئن ڊي اين اي پوليمريز کي پابند ڪرڻ لاءِ هڪ مستحڪم ڊبل اسٽرينڊ ٽيمپليٽ ٺاهيو وڃي.
پرائمر کي ڊزائين ڪرڻ لاءِ سافٽ ويئر استعمال ڪرڻ وقت، پرائمر جي ڊگھائي TM قدر جي حساب سان طئي ڪري سگھجي ٿي، خاص طور تي فلوروسينس مقداري PCR جي پرائمر لاءِ، TM = 60℃ يا ائين ڪنٽرول ٿيڻ گھرجي.
2. جي سي مواد
عام طور تي، پرائمر جي ترتيبن ۾ G+C جو مواد 40% ~ 60% هوندو آهي، ۽ GC مواد ۽ Tm قدر کي پرائمر جي هڪ جوڙي جي هموار ٿيڻ گهرجي.جيڪڏهن پرائمر ۾ هڪ سنجيده GC يا AT رجحان آهي، مناسب مقدار ۾ A، T يا G ۽ C دم کي پرائمر جي 5 جي آخر ۾ شامل ڪري سگھجي ٿو.
3. annealing گرمي پد
annealing گرمي پد 5 ℃ unchain گرمي پد کان گهٽ هجڻ گهرجي.جيڪڏهن پرائمر بنيادن جو تعداد ننڍڙو آهي، اينيلنگ جي درجه حرارت کي مناسب طور تي وڌائي سگهجي ٿو، جيڪو پي سي آر جي خاصيت کي وڌائي سگھي ٿو.جيڪڏهن بنيادن جو تعداد وڏو آهي، انيلنگ جي درجه حرارت کي مناسب طور تي گهٽائي سگهجي ٿو.4 ℃ ~ 6 ℃ جي پرائمر جي هڪ جوڙي جي وچ ۾ annealing گرمي پد جو فرق PCR جي پيداوار تي اثر انداز نه ڪندو، پر مثالي طور تي پرائمر جي هڪ جوڙي جو annealing گرمي پد ساڳيو آهي، جيڪو 55 ℃ ~ 75 ℃ جي وچ ۾ مختلف ٿي سگهي ٿو.
4. ايمپليفڪيشن ٽيمپليٽ جي ثانوي ساخت واري علائقي کان بچو
اهو بهتر آهي ته ٽيمپليٽ جي ثانوي ڍانچي واري علائقي کان پاسو ڪيو وڃي جڏهن ايمپليل ٿيل ٽڪرا چونڊيو وڃي.ھدف جي ٽڪري جي مستحڪم ثانوي ساخت جي اڳڪٿي ڪري سگھجي ٿي ۽ اندازو لڳائي سگھجي ٿو لاڳاپيل ڪمپيوٽر سافٽ ويئر، جيڪو ٽيمپليٽ جي چونڊ لاءِ مددگار آھي.تجرباتي نتيجن مان ظاهر ٿئي ٿو ته توسيع اڪثر ناڪام ٿي ويندي آهي جڏهن ته وڌائڻ واري علائقي جي آزاد توانائي (△G) 58.6lkJ/mol کان گهٽ هوندي آهي.
5. ٽارگيٽ ڊي اين اي سان بي ميل
جڏهن وڌايل ٽارگيٽ ڊي اين اي جي ترتيب وڏي آهي، هڪ پرائمر ٽارگيٽ ڊي اين اي جي ڪيترن ئي حصن کي پابند ڪري سگهي ٿو، نتيجي ۾ ڪيترن ئي بينڊن جي نتيجي ۾ ظاهر ٿئي ٿي.هن وقت ان کي استعمال ڪرڻ ضروري آهي BLAST سافٽ ويئر جاچ، ويب سائيٽ:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.منتخب ڪريو ٻه ترتيبون ترتيب ڏيو (bl2seq).
زون 1 ۾ پرائمر جي ترتيبن کي پيسٽ ڪرڻ ۽ ڊي اين اي جي ترتيبن کي زون 2 ڏانھن ھدف ڪرڻ قابل مٽا سٽا آھي، ۽ BLAST مڪمل، اينٽيسينس، ۽ ٻين امڪانن جو حساب ڪري ٿو، تنھنڪري صارفين کي نوٽيس ڪرڻ جي ضرورت ناھي ته ڇا ٻئي زنجير احساس زنجير آھن.توھان پڻ GI نمبر داخل ڪري سگھو ٿا جيڪڏھن توھان ڄاڻو ٿا ته ڊيٽابيس ۾ ترتيب جو GI نمبر، تنھنڪري توھان کي ترتيب جي وڏي حصي کي پيسٽ ڪرڻ جي ضرورت نه آھي.آخرڪار، ڪلڪ ڪريو Align at 3 ڏسڻ لاءِ ته ڇا پرائمر کي ٽارگيٽ ڊي اين اي ۾ گھڻا homologous سائيٽون آھن.
6. پرائمر ٽرمينل
3 'پرائمر جي پڇاڙي آهي جتي واڌارو شروع ٿئي ٿو، تنهنڪري اهو ضروري آهي ته بي ميلن کي اتي شروع ٿيڻ کان روڪڻ لاء.3 جي پڇاڙي 3 کان وڌيڪ مسلسل G يا C کان وڌيڪ نه هجڻ گهرجي، ڇاڪاڻ ته اهو پرائمر کي G+C جي افزودگي جي ترتيب واري علائقي ۾ غلطي سان شروع ڪرڻ جو سبب بڻائيندو.3 'آخر ڪنهن به ثانوي ڍانچي کي ٺاهي نٿو سگهي، سواء خاص PCR (AS-PCR) ردعمل ۾، پرائمر جي 3′ پڇاڙي بي ترتيب نه ٿي سگهي.مثال طور، جيڪڏهن انڪوڊنگ واري علائقي کي وڌايو ويو آهي، پرائمر جي 3 جي آخر کي ڪوڊون جي ٽين پوزيشن تي ختم نه ڪيو وڃي، ڇاڪاڻ ته ڪوڊون جي ٽين پوزيشن خراب ٿيڻ جو امڪان آهي، جيڪو ايمپليفڪيشن جي خاصيت ۽ ڪارڪردگي کي متاثر ڪندو.اينڪسيشن پرائمر استعمال ڪرڻ وقت، ڪوڊون استعمال ڪرڻ واري ٽيبل ڏانهن رجوع ڪريو، حياتياتي ترجيحن تي ڌيان ڏيو، 3′ آخر ۾ اينڪسيشن پرائمر استعمال نه ڪريو، ۽ پرائمر جي وڌيڪ ڪنسنٽريشن (1uM-3uM) استعمال ڪريو.
7. پرائمري جي ثانوي جوڙجڪ
پرائمر کي پاڻ ۾ مڪمل ڪرڻ وارا تسلسل نه هئڻ گهرجن، ٻي صورت ۾ پرائمر پاڻ ئي هيئرپن جي ڍانچي ۾ ڦاٿل هوندا، ۽ هي ثانوي ڍانچي اسٽيريڪ رڪاوٽ جي ڪري پرائمر ۽ ٽيمپليٽس جي بائنڊنگ کي متاثر ڪندو.جيڪڏهن مصنوعي فيصلي کي استعمال ڪيو وڃي، پرائمر جي مسلسل مڪمل طور تي 3bp کان وڌيڪ نه هجڻ گهرجي.ٻن پرائمر جي وچ ۾ ڪو به مڪمل نه هجڻ گهرجي، خاص طور تي 3 جي آخر جي مڪمل اوورليپ کان بچڻ گهرجي پرائمر ڊيمرز جي ٺهڻ کان بچڻ لاء.عام طور تي، پرائمر جي هڪ جوڙي جي وچ ۾ 4 کان وڌيڪ لڳاتار بيس هومولوجي يا مڪمل نه هجڻ گهرجي.
8. مارڪر يا لوسي شامل ڪريو
5 جي پڇاڙيءَ جو اثر ٿورڙو اثر آھي امپليفڪيشن جي خصوصيت تي ۽ ان ڪري ترميم ڪري سگھجي ٿو بغير امپليفڪيشن جي خصوصيت کي متاثر ڪرڻ جي.پرائمر 5 جي آخر ۾ ترميم شامل ڪئي وئي: enzyme پابندي سائيٽ شامل ڪرڻ؛ليبل ٿيل biotin, fluorescence, digoxin, Eu3+, etc. متعارف ڪرايو پروٽين بائنڊنگ ڊي اين اي ترتيبون؛ميوٽيشن جي سائيٽن کي متعارف ڪرائڻ، ميوٽيشن جي ترتيبن کي داخل ڪرڻ ۽ غائب ڪرڻ ۽ پروموٽر جي ترتيبن کي متعارف ڪرائڻ، وغيره. اضافي بيسز ايمپليفڪيشن جي ڪارڪردگي کي گهٽ يا گهٽ اثر انداز ڪندا ۽ پرائمر ڊائمر ٺهڻ جو موقعو وڌائيندو، پر ايندڙ قدم لاءِ ڪجهه رعايتون ڪرڻ گهرجن.اضافي ترتيبون جيڪي ھدف جي ترتيب تي موجود نه آھن، جھڙوڪ پابنديون سائيٽون ۽ پروموٽر ترتيبون، شامل ڪري سگھجن ٿيون 5′ پرائمر جي آخر ۾ خاصيت کي متاثر ڪرڻ کانسواءِ.اهي ترتيبون شامل نه آهن پرائمر Tm قدرن جي حساب سان، پر انهن کي مڪمل ڪرڻ ۽ اندروني ثانوي ڍانچي لاءِ آزمايو وڃي.
9. سبڪلون
اڪثر وقت، PCR صرف ابتدائي ڪلوننگ آهي، ۽ پوء اسان کي مختلف ویکٹرز ۾ ٽارگيٽ ٽڪڙي کي ذيلي ڪلون ڪرڻ جي ضرورت آهي، تنهنڪري اسان کي PCR قدم ۾ ايندڙ آپريشن لاء اضافي بنيادن کي ڊزائين ڪرڻ جي ضرورت آهي.
ذيلي ڪلوننگ لاءِ ٺهيل ڪجهه ترتيبن جو خلاصو هيٺ ڏجي ٿو.
پابندي endonuclease پابندي سائيٽ شامل ڪئي وئي
اينزيم پابندي واري سائيٽن کي شامل ڪرڻ PCR پروڊڪٽس کي ذيلي ڪلون ڪرڻ لاءِ سڀ کان عام استعمال ٿيل طريقو آهي.عام طور تي، cleavage سائيٽ ڇهن bases آهي، ان کان علاوه 5 cleavage سائيٽ جي آخر ۾ 2 ~ 3 حفاظتي bases شامل ڪرڻ جي ضرورت آهي.جڏهن ته، مختلف اينزيميمس طرفان گهربل حفاظتي بنيادن جو تعداد مختلف آهي.مثال طور، SalⅠ کي حفاظتي بنياد جي ضرورت ناهي، EcoRⅤ کي 1 حفاظتي بنياد جي ضرورت آهي، NotⅠ کي 2 حفاظتي بنيادن جي ضرورت آهي، ۽ HindⅢ کي 3 حفاظتي بنيادن جي ضرورت آهي.
LIC دم شامل ڪري ٿو
LIC جو پورو نالو Ligation-Independent cloning آهي، ڪلوننگ جو طريقو Navogen پاران خاص طور تي ان جي پي اي ٽي ویکٹر جي حصي لاءِ ايجاد ڪيو ويو آهي.LIC طريقي سان تيار ڪيل پي اي ٽي ڪيريئر ۾ غير مڪمل 12-15 بيس سنگل اسٽرينڊ اسٽڪي اينڊس آهن، جيڪي ٽارگيٽ داخل ٿيل ٽڪرا تي لاڳاپيل چپچپا سرن کي مڪمل ڪن ٿا.وڌائڻ جي مقصدن لاء، داخل ٿيل ٽڪرا جو پرائمر 5′ تسلسل LIC ویکٹر کي پورو ڪرڻ گهرجي.T4 DNA پوليمريز جي 3′→5′ خارجي سرگرمي ٿوري وقت کان پوءِ داخل ٿيل ٽڪڙي تي هڪ سنگل اسٽرينڊ چپڪي آخر ٺاهي سگهي ٿي.ڇاڪاڻ ته پيداوار صرف تيار ٿيل داخل ٿيل ٽڪرا ۽ ویکٹر جي گڏيل اينيلنگ مان ٺاهي سگهجي ٿي، اهو طريقو تمام تيز ۽ ڪارائتو آهي، ۽ اهو ڪلوننگ جي هدايت ڪئي وئي آهي.
هدايت ڪئي TA کلون شامل دم
TA ڪلوننگ ٽڪڙي کي ویکٹر ۾ نشانو بڻائڻ جي قابل نه هئي، تنهنڪري بعد ۾ Invitrogen هڪ ویکٹر متعارف ڪرايو جيڪو ڪلوننگ کي نشانو بڻائي سگهي ٿو، جنهن ۾ هڪ آخر ۾ چار نمايان بنيادي GTGGS شامل آهن.تنهن ڪري، پي سي آر پرائمر جي ڊيزائن ۾، مڪمل طور تي ترتيب ڏنل ترتيبن کي شامل ڪيو وڃي، ته جيئن ٽڪرا "مرڪز" ٿي سگهن.
جيڪڏهن توهان وٽ وقت گهٽ آهي، توهان ڪوشش ڪري سگهو ٿا سڌي سنٿيسس، جين کي ویکٹر سان گڏ ڪري، جنهن کي اسان ميوزيڪلسٽن ۾ اي ٽي جين سنٿيسس چوندا آهيون.
D. ان-فيوزن ڪلوننگ جو طريقو
ڪابه ligase گهربل ناهي، ڊگهي ردعمل جي ضرورت ناهي.جيستائين لڪيرائيز ویکٹر جي ٻنهي سرن تي هڪ تسلسل پيش ڪيو ويندو آهي پرائمر جي ڊيزائن ۾، پوءِ پي سي آر پراڊڪٽ ۽ لڪيرائيز ویکٹر کي ان-فيوژن اينزائم سلوشن ۾ شامل ڪيو ويندو آهي جنهن ۾ BSA هوندو آهي ۽ اڌ ڪلاڪ لاءِ ڪمري جي گرمي پد تي رکيل هوندو آهي، ٽرانسفارميشن ڪري سگهجي ٿي.اهو طريقو خاص طور تي وڏي مقدار جي بدلي لاء مناسب آهي.
10. پرائمر کي گڏ ڪريو
ڪڏهن ڪڏهن، پرائمر ڊيزائن جي باري ۾ صرف محدود ترتيب جي ڄاڻ ڄاڻايل آهي.مثال طور، جيڪڏهن صرف امينو اسيد جي ترتيب معلوم ٿئي ٿي، ضم ڪرڻ واري پرائمر کي ڊزائين ڪري سگهجي ٿو.هڪ ضمير پرائمر مختلف ترتيبن جو هڪ مرکب آهي جيڪو سڀني مختلف بنيادي امڪانن جي نمائندگي ڪري ٿو جيڪو هڪ واحد امينو اسيد کي انڪوڊ ڪري ٿو.خاصيت کي وڌائڻ لاءِ، توھان حوالو ڪري سگھو ٿا ڪوڊون استعمال ٽيبل کي گھٽائڻ لاءِ مختلف جاندارن جي بنيادي استعمال جي ترجيحن جي مطابق.Hypoxanthine کي پرائمر جي annealing گرمي پد کي گھٽائڻ لاء سڀني بنيادن سان ملائي سگھجي ٿو.پرائمر جي 3′ آخر ۾ ضم ٿيل بيس استعمال نه ڪريو ڇاڪاڻ ته 3′ آخر ۾ آخري 3 بيسز جي انيلنگ غلط سائيٽ تي PCR شروع ڪرڻ لاءِ ڪافي آهي.اعليٰ پرائمر ڪنسنٽريشن (1μM کان 3μM) استعمال ڪيا ويندا آهن ڇاڪاڻ ته ڪيترن ئي ملائيندڙ مرکبن ۾ پرائمر ٽارگيٽ ٽيمپليٽ لاءِ مخصوص نه هوندا آهن.
PCR خام مالڪنٽرول
1. پرائمر مقدار
هر پرائمر جي ڪنسنٽريشن 0.1 ~ 1umol يا 10 ~ 100pmol آهي.اهو بهتر آهي ته گهربل نتيجو پيدا ڪرڻ لاء پرائمر جي گھٽ مقدار سان.پرائمر جي اعلي ڪنسنٽريشن بي ميلاپ ۽ غير مخصوص ايمپليفڪيشن جو سبب بڻجندي، ۽ پرائمر جي وچ ۾ ڊيمر ٺهڻ جو موقعو وڌائيندو.
2. پرائمر ڪنسنٽريشن
پرائمر جي ڪنسنٽريشن خاصيت کي متاثر ڪري ٿي.بهترين پرائمر ڪنسنٽريشن عام طور تي 0.1 ۽ 0.5μM جي وچ ۾ آهي.اعليٰ پرائمر ڪنسنٽريشن غير مخصوص شين جي واڌاري جو سبب بڻجن ٿا.
3. primer جي annealing گرمي پد
پرائمري لاء هڪ ٻيو اهم پيٽرولر پگھلڻ جي درجه حرارت (Tm) آهي.هي اهو گرمي پد آهي جڏهن 50 سيڪڙو پرائمر ۽ ڪمپليمينٽري سيڪيونس کي ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي ماليڪيولز طور پيش ڪيو ويندو آهي.Tm PCR annealing گرمي پد مقرر ڪرڻ جي ضرورت آهي.مثالي طور تي، annealing گرمي پد ڪافي گهٽ آهي ته جيئن ٽارگيٽ جي ترتيب سان پرائمر جي مؤثر اينيلنگ کي يقيني بڻائي سگهجي، پر غير مخصوص بائنڊنگ کي گهٽائڻ لاءِ ڪافي تيز آهي.55 ℃ کان 70 ℃ تائين مناسب annealing گرمي پد.annealing گرمي پد عام طور تي مقرر ڪيو ويو آهي 5 ℃ پريمر جي Tm کان گهٽ.
Tm ترتيب ڏيڻ لاءِ ڪيترائي فارمولا آھن، جيڪي استعمال ٿيل فارمولا ۽ پرائمر جي ترتيب جي لحاظ کان تمام گھڻو مختلف آھن.ڇاڪاڻ ته گھڻا فارمولا هڪ اندازي مطابق Tm قدر مهيا ڪن ٿا، سڀ اينيلنگ گرمي پد صرف هڪ شروعاتي نقطي آهن.خاصيت کي بهتر ڪري سگهجي ٿو ڪيترن ئي رد عملن جو تجزيو ڪندي جيڪو ترقي سان اينيلنگ جي درجه حرارت کي وڌائي ٿو.اندازي مطابق Tm-5 ℃ کان هيٺ شروع ڪريو، ۽ تدريجي طور تي 2 ℃ جي واڌ ۾ annealing گرمي پد کي وڌايو.اعلي annealing گرمي پد پرائمر dimers ۽ غير مخصوص مصنوعات جي ٺهڻ کي گهٽائيندو.بھترين نتيجن لاءِ، ٻن پرائمر کي لڳ ڀڳ Tm قدر ھجڻ گھرجي.جيڪڏهن پرائمر جوڑوں جو Tm فرق 5 ℃ کان وڌيڪ آهي، پرائمر چڪر ۾ گهٽ اينيلنگ درجه حرارت استعمال ڪندي هڪ اهم غلط شروعات ڏيکاريندا.جيڪڏهن ٻه پرائمر Tm مختلف آهن، annealing جي درجه حرارت کي 5 ℃ گھٽ ۾ گھٽ Tm کان گھٽ ڪريو.متبادل طور تي، خاصيت وڌائڻ لاءِ، پنجن چڪرن کي پھريان ڪري سگھجن ٿا اينيلنگ گرمي پد تي جيڪي اعليٰ Tm لاءِ ٺهيل آھن، ان کان پوءِ باقي چڪر ھيٺين Tm لاءِ تيار ڪيل اينيلنگ گرمي پد تي.هي اجازت ڏئي ٿو ته منزل واري ٽيمپليٽ جي هڪ جزوي ڪاپي سخت حالتن ۾ حاصل ڪئي وڃي.
4. پرائمر پاڪائي ۽ استحڪام
ڪسٽم پرائمر جي معياري پاڪائي اڪثر PCR ايپليڪيشنن لاءِ ڪافي آهي.benzoyl ۽ isobutylyl گروپن کي ختم ڪرڻ سان ختم ڪرڻ گھٽ ۾ گھٽ آھي ۽ تنھنڪري PCR سان مداخلت نٿو ڪري.ڪجهه ايپليڪيشنن کي صاف ڪرڻ جي ضرورت آهي ته ڪنهن به غير مڪمل ڊگھائي ترتيبن کي ختم ڪرڻ جي عمل ۾.اهي ٽڪرا ٽڪرا ٿي ويندا آهن ڇاڪاڻ ته ڊي اين اي سنٿيسس ڪيمسٽري جي ڪارڪردگي 100٪ نه آهي.هي هڪ گول عمل آهي جيڪو بار بار ڪيميائي رد عمل کي استعمال ڪندو آهي جيئن هر بنياد کي 3′ کان 5′ تائين DNA ٺاهڻ لاءِ شامل ڪيو ويندو آهي.توهان ڪنهن به چڪر ۾ ناڪام ٿي سگهو ٿا.ڊگھا پرائمر، خاص طور تي جيڪي 50 بيسز کان وڌيڪ آھن، انھن ۾ ٽڪرا ٽڪرا ٽڪرا آھن ۽ انھن کي صاف ڪرڻ جي ضرورت ٿي سگھي ٿي.
پرائمر جي پيداوار مصنوعي ڪيمسٽري ۽ صاف ڪرڻ واري طريقي جي ڪارڪردگي سان متاثر ٿيندي آهي.بائيو دواسازي ڪمپنيون، جهڙوڪ سائٽولوجي ۽ شينگونگ، سڀئي oligonucleoside جي مجموعي پيداوار کي يقيني بڻائڻ لاء گهٽ ۾ گهٽ OD يونٽ استعمال ڪن ٿا.ڪسٽم پرائمر خشڪ پاؤڊر فارم ۾ موڪليا ويا آهن.اهو بهترين آهي ته TE ۾ پرائمر کي ٻيهر حل ڪيو وڃي ته جيئن آخري ڪنسنٽريشن 100μM آهي.TE deionized پاڻي کان بهتر آهي ڇاڪاڻ ته پاڻي جو pH اڪثر تيزابي هوندو آهي ۽ oligonucleosides جي هائيڊولائيزيشن جو سبب بڻجندو آهي.
پرائمر جي استحڪام تي اسٽوريج جي حالتن تي منحصر آهي.خشڪ پائوڊر ۽ ٽوڙيل پرائمر کي -20 ℃ تي ذخيرو ڪيو وڃي.TE ۾ تحلیل ٿيل پرائمر 10μM کان وڌيڪ ڪنسنٽريشن تي -20 ℃ تي 6 مھينن لاءِ مستحڪم طور تي ذخيرو ٿي سگھن ٿا، پر صرف 1 ھفتي کان گھٽ لاءِ ڪمري جي حرارت (15 ℃ کان 30 ℃) تي محفوظ ڪري سگھجي ٿو.خشڪ پائوڊر پرائمر کي -20 سينٽي گريڊ تي گھٽ ۾ گھٽ 1 سال ۽ ڪمري جي گرمي پد (15 C کان 30 C) تي 2 مھينن تائين محفوظ ڪري سگھجي ٿو.
5. اينزايمز ۽ انهن جو مقدار
هن وقت، Taq DNA پوليميرس استعمال ڪيو ويو آهي بنيادي طور تي جين انجنيئرنگ اينزائم آهي جيڪو ڪليفارم بيڪٽيريا پاران ٺهيل آهي.هڪ عام پي سي آر رد عمل کي متحرڪ ڪرڻ لاءِ گهربل اينزيم جي مقدار تقريبن 2.5U آهي (100ul جي ڪل رد عمل جي مقدار ڏانهن اشارو آهي).جيڪڏهن ڪنسنٽريشن تمام گهڻي آهي، ته اهو غير مخصوص واڌارو ٿي سگهي ٿو.جيڪڏهن ڪنسنٽريشن تمام گهٽ آهي، مصنوعي پيداوار جي مقدار گھٽجي ويندي.
6. ڊي اين ٽي پي جي معيار ۽ ڪنسنٽريشن
dNTP جي معيار کي ويجهي سان لاڳاپيل آهي ڪنسنٽريشن ۽ ڪارڪردگي PCR امپليڪشن جي ڪارڪردگي سان.dNTP پائوڊر گرينولر آهي، ۽ ان جي تبديلي ان جي حياتياتي سرگرمي کي وڃائي ٿو جيڪڏهن اهو غلط طور تي ذخيرو ٿيل آهي.dNTP حل تيزابي آهي، ۽ 1M NaOH يا 1M Tris.HCL بفر حل سان اعلي ڪنسنٽريشن ۾ استعمال ڪيو وڃي. ان جي پي ايڇ کي 7.0 ~ 7.5 تائين ترتيب ڏيڻ لاء، ذيلي پيڪنگنگ جي ننڍڙي مقدار، منجمد اسٽوريج -20℃ تي.گھڻن منجهيل پگھلڻ dNTP کي خراب ڪندو.PCR ردعمل ۾، dNTP 50 ~ 200umol/L هجڻ گهرجي.خاص طور تي، ڌيان ڏيڻ گهرجي ته چار DNTPS جي ڪنسنٽريشن برابر هجڻ گهرجي (برابر تل تيار ڪرڻ).جيڪڏهن انهن مان ڪنهن هڪ جي ڪنسنٽريشن ٻين کان مختلف آهي (وڌيڪ يا هيٺيون)، بي ترتيبي سبب ٿيندي.تمام گھٽ ڪنسنٽريشن PCR مصنوعات جي پيداوار کي گھٽائي ڇڏيندو.dNTP Mg2+ سان گڏ ڪري سگھي ٿو ۽ مفت Mg2+ جي ڪنسنٽريشن کي گھٽائي سگھي ٿو.
7. ٽيمپليٽ (ٽارگٽ جين) نيوڪليڪ ايسڊ
ٽيمپليٽ نيوڪليڪ ايسڊ جي مقدار ۽ صاف ڪرڻ جي درجي PCR جي ڪاميابي يا ناڪامي لاء اهم لنڪ مان هڪ آهي.روايتي ڊي اين اي صاف ڪرڻ جا طريقا عام طور تي SDS ۽ پروٽيز K استعمال ڪن ٿا نمونن کي هضم ڪرڻ ۽ ڊسپوز ڪرڻ لاءِ.SDS جا مکيه ڪم آهن: سيل جھلي تي لپيد ۽ پروٽين کي ڦهلائڻ، اهڙيء طرح سيل جھلي کي تباهه ڪندي جھلي پروٽينن کي ڦهلائي، ۽ سيل ۾ ايٽمي پروٽينن کي الڳ ڪري ٿو، SDS پڻ پروٽينن سان گڏ ڪري سگهي ٿو ۽ تيز ٿي سگهي ٿو.Protease K پروٽينن کي هائيڊولائيز ۽ هضم ڪري سگهي ٿو، خاص ڪري ڊي اين اي سان جڙيل هسٽون، ۽ پوءِ پروٽين ۽ ٻين سيل جزن کي ڪڍڻ لاءِ آرگنڪ سولوينٽ فينول ۽ ڪلوروفارم استعمال ڪري ٿو، ۽ نيوڪليڪ ايسڊ کي تيز ڪرڻ لاءِ ايٿانول يا آئوسوپروپيل الڪوحل استعمال ڪري ٿو.ڪڍيل nucleic امل PCR رد عمل لاء هڪ ٽيمپليٽ طور استعمال ڪري سگهجي ٿو.عام ڪلينڪ جي چڪاس جي نمونن لاءِ، هڪ تڪڙو ۽ سادو طريقو استعمال ڪري سگهجي ٿو سيلز کي ٽوڙڻ، ليسيٽ پيٿوجنز، هضم ڪرڻ ۽ پروٽين کي ڪروموزوم مان هٽائڻ لاءِ آزاد ٽارگيٽ جينز تائين، ۽ سڌو سنئون PCR امپليفڪيشن لاءِ استعمال ڪيو وڃي ٿو.آر اين اي ٽيمپليٽ ڪڍڻ عام طور تي استعمال ڪري ٿو guanidine isothiocyanate يا protease K طريقو RNase کي RNA کي خراب ٿيڻ کان روڪڻ لاءِ.
8.Mg2+ ڪنسنٽريشن
Mg2+ PCR amplification جي خاصيت ۽ پيداوار تي هڪ اهم اثر آهي.عام PCR ردعمل ۾، جڏهن مختلف dNTP جو ڪنسنٽريشن 200umol/L هوندو آهي، Mg2+ جو مناسب ڪنسنٽريشن 1.5 ~ 2.0mmol/L هوندو آهي.Mg2+ ڪنسنٽريشن تمام گهڻو آهي، رد عمل جي خاصيت گهٽجي ٿي، غير مخصوص واڌارو ٿئي ٿو، تمام گهٽ ڪنسنٽريشن Taq DNA پوليميرس جي سرگرمي کي گهٽائي ڇڏيندو، جنهن جي نتيجي ۾ رد عمل جي مصنوعات جي گهٽتائي ٿيندي.
ميگنيشيم آئنز پي سي آر جي ڪيترن ئي حصن تي اثر انداز ڪن ٿا، جهڙوڪ ڊي اين اي پوليميرس سرگرمي، جيڪا پيداوار کي متاثر ڪري ٿي؛ٻيو مثال پرائمر اينيلنگ آهي، جيڪو خاصيت کي متاثر ڪري ٿو.dNTP ۽ ٽيمپليٽ ميگنيشيم آئن سان جڙيل آهي، اينزيم سرگرمي لاء گهربل مفت ميگنيشيم آئن جي مقدار کي گھٽائڻ.بهترين ميگنيشيم آئن ڪنسنٽريشن مختلف پرائمر جوڑوں ۽ ٽيمپليٽس لاءِ مختلف هوندو آهي، پر 200μM dNTP سان هڪ عام PCR شروعاتي ڪنسنٽريشن 1.5mM آهي (نوٽ: حقيقي وقت جي مقداري PCR لاءِ، فلورسنٽ پروبي سان 3 کان 5 ايم ايم ميگنيشيم آئن حل استعمال ڪريو).مفت ميگنيشيم آئن جي اعلي مقدار جي پيداوار وڌائي ٿي، پر غير مخصوص واڌارو پڻ وڌائي ٿي ۽ وفاداري گھٽائي ٿي.بهترين ڪنسنٽريشن کي طئي ڪرڻ لاءِ، ميگنيشيم آئن ٽائيٽل 0.5mM جي واڌ ۾ 1mM کان 3mM تائين ڪيا ويا.ميگنيشيم آئن جي اصلاح تي انحصار کي گھٽائڻ لاءِ، پلاٽينم ٽاڪ ڊي اين اي پوليميرس استعمال ڪري سگھجي ٿو.پلاٽينم ٽائيڪ ڊي اين اي پوليمريز تاڪ ڊي اين اي پوليميرس جي ڀيٽ ۾ ميگنيشيم آئن ڪنسنٽريشن جي وسيع رينج تي ڪم کي برقرار رکڻ جي قابل آهي ۽ ان ڪري گهٽ اصلاح جي ضرورت آهي.
9. Pcr-پروموشن additives
اينيلنگ جي گرمي پد جي اصلاح، پرائمر ڊيزائن، ۽ ميگنيشيم آئن ڪنسنٽريشن اڪثر ٽيمپليٽس جي انتهائي مخصوص ايمپليفڪيشن لاءِ ڪافي آهي.جڏهن ته، ڪجهه ٽيمپليٽ، جن ۾ اعليٰ GC مواد شامل آهن، اضافي قدمن جي ضرورت آهي.اضافو جيڪي ڊي اين اي جي پگھلڻ واري درجه حرارت کي متاثر ڪن ٿا پيداوار جي خاصيت ۽ پيداوار کي بهتر ڪرڻ لاء هڪ ٻيو طريقو مهيا ڪن ٿا.بهترين نتيجن لاءِ ٽيمپليٽ جي مڪمل تشريح جي ضرورت آهي.
ان کان سواء، ثانوي ڍانچي کي پرائمر بائنڊنگ ۽ اينزيم جي واڌ کي روڪي ٿو.
PCR additives، بشمول فارمامائيڊ، DMSO، گليسرين، بيٽين، ۽ پي سي آرڪس وڌائڻ وارو حل، واڌارو وڌائڻ.انهن جو ممڪن ميڪانيزم اهو آهي ته پگھلڻ جي درجه حرارت کي گهٽائڻ، اهڙيء طرح پرائمر جي اينيلنگ کي مدد ڏيڻ ۽ ثانوي ساخت واري علائقي جي ذريعي ڊي اين اي پوليمريس جي واڌ ۾ مدد ڪندي.PCRx حل ٻيا فائدا آھن.گھٽ ۾ گھٽ مگنيشيم آئن جي اصلاح جي ضرورت آھي جڏھن پلاٽينم ٽائيڪ ڊي اين اي پوليميرس ۽ پلاٽينم پي ايفڪس ڊي اين اي پوليمريس سان استعمال ڪيو وڃي.اهڙيء طرح، پلاٽينم ٽيڪنڪ کي اضافو سان گڏ ڪيو ويو آهي خاصيت کي وڌائڻ لاء جڏهن ته ٽئين طريقي جي انحصار کي گهٽائڻ، ميگنيشيم آئن اصلاح.بهترين نتيجن لاء، additives جي ڪنسنٽريشن کي بهتر ڪرڻ گهرجي، خاص طور تي DMSO، فارمامائيڊ، ۽ گليسرول، جيڪي ٽائيڪ ڊي اين اي پوليمريز کي روڪيندا آهن.
10. گرم شروع
گرم شروع ٿيندڙ پي سي آر بهترين پرائمر ڊيزائن کان علاوه پي سي آر جي خاصيت کي بهتر ڪرڻ لاءِ سڀ کان اهم طريقن مان هڪ آهي.جيتوڻيڪ Taq DNA پوليمريز جو وڌ ۾ وڌ وڌاءُ وارو گرمي پد 72 ℃ آهي، پوليمريز ڪمري جي حرارت تي سرگرم رهي ٿو.اهڙيء طرح، غير مخصوص مصنوعات پيدا ٿينديون آهن جڏهن پي سي آر جي رد عمل جي تياري دوران ۽ حرارتي چڪر جي شروعات ۾ رکڻ جي درجه حرارت اينيلنگ جي درجه حرارت کان گهٽ آهي.هڪ دفعو ٺهرايو، اهي غير مخصوص شين کي مؤثر طور تي وڌايو ويو آهي.گرم-شروع PCR خاص طور تي اثرائتو آهي جڏهن پرائمر ڊيزائن لاءِ استعمال ٿيل سائيٽون جينياتي عنصرن جي مقام تائين محدود هونديون آهن، جهڙوڪ سائيٽ جي هدايت واري ميوٽيشنز، ايڪسپريشن ڪلوننگ، يا ڊي اين اي انجنيئرنگ لاءِ استعمال ٿيندڙ جينياتي عناصر جي تعمير ۽ ڦيرڦار.
Taq DNA پوليمريز جي سرگرمي کي محدود ڪرڻ جو هڪ عام طريقو برف تي پي سي آر جي رد عمل جو حل تيار ڪرڻ ۽ ان کي اڳئين گرم ٿيل پي سي آر اپريٽس ۾ رکڻ آهي.اهو طريقو سادو ۽ سستو آهي، پر اهو اينزيم جي سرگرمي کي پورو نٿو ڪري ۽ تنهنڪري غير مخصوص شين جي پيداوار کي مڪمل طور تي ختم نٿو ڪري.
حرارتي پرائمنگ هڪ ضروري جزو کي روڪيندي ڊي اين اي جي ٺهڻ ۾ دير ڪري ٿي جيستائين پي سي آر اپريٽس ڊينيچريشن جي درجه حرارت تي پهچي.اڪثر دستي حرارتي شروعات جا طريقا، بشمول تاڪ ڊي اين اي پوليمريز جي دير سان شامل ڪرڻ، مشڪل آهن، خاص طور تي اعليٰ ذريعي جي ايپليڪيشنن لاءِ.ٻيا حرارتي پرائمنگ طريقا استعمال ڪن ٿا موم شيلڊ کي لازمي جزو کي بند ڪرڻ لاءِ، بشمول ميگنيشيم آئنز يا اينزائمز، يا جسماني طور تي رد عمل واري اجزاء کي الڳ ڪرڻ، جهڙوڪ ٽيمپليٽس ۽ بفرز.حرارتي چڪر دوران، مختلف اجزاء ڇڏيا ويندا آهن ۽ هڪ ٻئي سان ملايا ويندا آهن جيئن موم پگھلندو آهي.دستي گرم شروع ڪرڻ واري طريقي وانگر، موم جي شيلڊ جو طريقو مشڪل ۽ آلودگي جو شڪار آهي ۽ اعلي ٿرو پُٽ ايپليڪيشنن لاءِ مناسب ناهي.
پلاٽينم ڊي اين اي پوليميرس آسان ۽ ڪارائتو آهي خودڪار گرم شروع ٿيندڙ پي سي آر لاءِ.پلاٽينم ٽائيڪ ڊي اين اي پوليمريز تي مشتمل آهي recombinant تاق ڊي اين اي پوليمريز سان گڏ گڏيل طور تي مونوڪلونل اينٽي باڊي ٽاڪ ڊي اين اي پوليمريز جي خلاف.اينٽي باڊيز PCR پاران ٺاهيا ويا آهن ته جيئن ڊگهي گرمي پد جي دوران اينزيم جي سرگرمي کي روڪيو وڃي.تاڪ ڊي اين اي پوليمريز کي رد عمل ۾ جاري ڪيو ويو 94 ° سي ڊينيٽريشن قدم جي موصليت جي دوران، مڪمل پوليمريز سرگرمي کي بحال ڪندي.حرارتي شروعات لاءِ ڪيميائي طور تي تبديل ٿيل Taq DNA پوليمريز جي ابتڙ، پلاٽينم اينزيم کي 94℃ (10 کان 15 منٽ) تي ڊگھي موصليت جي ضرورت نه آهي پوليمريز کي چالو ڪرڻ لاءِ.پلاٽينم ٽاڪ ڊي اين اي پوليمريز سان، 90٪ تاق ڊي اين اي پوليمريز سرگرمي 2 منٽن کانپوءِ 94℃ تي بحال ڪئي وئي.
11. Nest-PCR
اينسٽڊ پرائمر استعمال ڪندي ايمپليفڪيشن جا لڳاتار دور مخصوصيت ۽ حساسيت کي بهتر بڻائي سگهن ٿا.پهريون دور 15 کان 20 چڪر جو هڪ معياري واڌارو آهي.شروعاتي ايمپليفڪيشن پراڊڪٽ جو ھڪڙو ننڍڙو حصو 100 کان 1000 ڀيرا گھٽايو ويو ۽ 15 کان 20 چڪر لاء ايمپليفڪيشن جي ٻئي دور ۾ شامل ڪيو ويو.متبادل طور تي، شروعاتي پراڊڪٽ جي پيداوار جيل صاف ڪرڻ سان ماپ ڪري سگھجي ٿو.ھڪڙو نسٽڊ پرائمر استعمال ڪيو ويندو آھي ايمپليفڪيشن جي ٻئي دور ۾، جيڪو پھرين پرائمر اندر ھدف جي ترتيب سان پابند ٿي سگھي ٿو.اينسٽڊ پي سي آر جو استعمال ڪيترن ئي ٽارگيٽ سائيٽن جي واڌ جي امڪان کي گھٽائي ٿو ڇاڪاڻ ته اتي ڪجھ ھدف واريون ترتيبون آھن جيڪي پرائمر جي ٻنهي سيٽن لاءِ مڪمل آھن.ساڳئي پرائمر سان گڏ سائيڪلن جو ساڳيو ڪل تعداد (30 کان 40) غير مخصوص سائيٽن کي وڌايو.Nested PCR محدود حدف جي ترتيبن جي حساسيت کي وڌائي ٿو (مثال طور، نادر مرناس) ۽ مشڪل PCRS جي خاصيت کي بهتر بڻائي ٿو (مثال طور 5′ RACE).
12. هيٺيون پي سي آر
هيٺيون پي سي آر پي سي آر جي پهرين ڪجھ چڪر لاءِ تنگ اينيلنگ شرطن کي استعمال ڪندي خاصيت کي بهتر بڻائي ٿو.چڪر لڳ ڀڳ 5 ℃ اندازي مطابق Tm کان وڌيڪ annealing گرمي پد تي شروع ٿئي ٿو، پوء هر چڪر 1 ℃ کان 2 ℃ تائين گھٽجي ويندي آهي جيستائين اينيلنگ جي درجه حرارت Tm 5 ℃ کان گهٽ ناهي.صرف منزل واري ٽيمپليٽ کي اعليٰ هومولوجي سان وڌايو ويندو.اهي پراڊڪٽس اڳتي وڌڻ واري چڪر ۾ وڌندا رهن ٿا، وڌايل غير مخصوص شين کي گڏ ڪندي.هيٺيون پي سي آر انهن طريقن لاءِ مفيد آهي جتي پرائمر ۽ ٽارگيٽ ٽيمپليٽ جي وچ ۾ هومولوجي جو درجو معلوم نه هجي، جهڙوڪ AFLP DNA فنگر پرنٽنگ.
لاڳاپيل PCR ڪٽس
2 × PCR هيروTMمڪس سسٽم ۾ عام پي سي آر مڪس سسٽم جي ڀيٽ ۾ پي سي آر انابيٽرز کي وڌيڪ رواداري آهي، ۽ آساني سان مختلف پيچيده ٽيمپليٽس جي پي سي آر ايمپليفڪيشن کي منهن ڏئي سگهي ٿو.منفرد رد عمل وارو نظام ۽ اعليٰ ڪارڪردگيءَ وارو Taq Hero PCR جي رد عمل کي وڌيڪ امپليفڪيشن ڪارڪردگي، مخصوصيت ۽ حساسيت ڏئي ٿو.
اعلي amplification ڪارڪردگي
ان ۾ 5'→ 3' ڊي اين اي پوليمريز سرگرمي ۽ 5'→ 3' Exonuclease سرگرمي آهي، بغير 3'→5' exonuclease سرگرمي.
حقيقي وقت PCR Easyᵀᴹ-SYBR گرين I کٽ
مخصوص-بهتر بفر ۽ گرم-شروع Taq اينزيم غير مخصوص ايمپليفڪيشن ۽ پرائمر ڊيمر ٺهڻ کي روڪي سگھي ٿو
اعلي حساسيت- ٽيمپليٽ جي گھٽ نقلن کي ڳولي سگھي ٿو
ڪِٽ استعمال ڪري ٿي هڪ منفرد Foregene reverse transscription reagent ۽ Foregene HotStar Taq DNA Polymerase هڪ منفرد رد عمل واري نظام سان گڏيل طريقي سان عمل جي ڪارڪردگي ۽ رد عمل جي خاصيت کي بهتر ڪرڻ لاءِ.
پوسٽ ٽائيم: مئي-09-2023
