• PCR ھڪڙو طريقو آھي جيڪو ڊي اين اي کي وڌائڻ لاء استعمال ڪيو ويندو آھي ڊي اين اي ٽيمپليٽ جي ننڍڙي مقدار مان.RT-PCR استعمال ڪري ٿو ريورس ٽرانسڪرپشن هڪ آر اين اي ماخذ مان ڊي اين اي ٽيمپليٽ پيدا ڪرڻ لاءِ جنهن کي پوءِ وڌائي سگهجي ٿو.
• PCR ۽ RT-PCR عام طور تي آخري نقطي رد عمل آهن، جڏهن ته qPCR ۽ RT-qPCR پي سي آر جي رد عمل جي دوران پراڊڪٽ جي ٺهڪندڙ جي شرح جي ڪينيٽيڪس کي استعمال ڪندا آهن ته جيئن موجود ٽيمپليٽ جي مقدار جو اندازو لڳايو وڃي.
• نوان طريقا، جهڙوڪ ڊجيٽل پي سي آر، ابتدائي ڊي اين اي ٽيمپليٽ جي مڪمل مقدار مهيا ڪن ٿا، جڏهن ته طريقن جهڙوڪ isothermal PCR قابل اعتماد نتيجا مهيا ڪرڻ لاء قيمتي سامان جي ضرورت کي گھٽائي ٿو.

پوليميرس زنجير رد عمل (PCR) هڪ نسبتا سادو ۽ وڏي پيماني تي استعمال ٿيندڙ ماليڪيولر بائيولوجي ٽيڪنڪ آهي جيڪو ڊي اين اي ۽ آر اين اي جي ترتيب کي وڌائڻ ۽ ڳولڻ لاءِ.ڊي اين اي ڪلوننگ ۽ ايمپليفڪيشن جي روايتي طريقن جي مقابلي ۾، جن ۾ اڪثر ڏينهن لڳن ٿا، پي سي آر کي صرف چند ڪلاڪن جي ضرورت آهي.PCR انتهائي حساس آهي ۽ مخصوص ترتيبن جي ڳولا ۽ وڌائڻ لاءِ گهٽ ۾ گهٽ ٽيمپليٽ جي ضرورت آهي.بنيادي پي سي آر طريقا سادو ڊي اين اي ۽ آر اين اي جي چڪاس کان اڳتي وڌيا آهن.هيٺ، اسان مختلف پي سي آر طريقن جو هڪ جائزو مهيا ڪيو آهي ۽ ريجنٽس جيڪي اسان توهان جي تحقيق جي ضرورتن لاءِ اينزو لائف سائنسز ۾ مهيا ڪندا آهيون.اسان جو مقصد آهي سائنسدانن جي مدد ڪرڻ لاءِ PCR ريجنٽس تائين پهچندي انهن جي ايندڙ تحقيقي منصوبي ۾ استعمال ڪرڻ لاءِ!

پي سي آر

معياري پي سي آر لاءِ، توهان کي ضرورت آهي هڪ ڊي اين اي پوليميرس، ميگنيشيم، نيوڪليوٽائيڊس، پرائمر، ڊي اين اي ٽيمپليٽ جنهن کي وڌايو وڃي، ۽ هڪ thermocycler.PCR ميڪانيزم ان جي مقصد جيتري سادو آهي: 1) ڊبل-اسٽرينڊ ڊي اين اي (dsDNA) گرميءَ کي رد ڪيو ويو آهي، 2) پرائمر سنگل ڊي اين اي اسٽرينڊز کي ترتيب ڏين ٿا، ۽ 3) پرائمر کي ڊي اين اي پوليمريز ذريعي وڌايو وڃي ٿو، جنهن جي نتيجي ۾ ٻه ڪاپيون پيدا ٿين ٿيون. اصل ڊي اين اي اسٽرينڊ.گرمي پد ۽ وقتن جي هڪ سيريز تي ڊينيچريشن، اينيلنگ، ۽ ڊگهو ٿيڻ واري عمل کي هڪ چڪر جي ايمپليفڪيشن طور سڃاتو وڃي ٿو (تصوير 1).

چڪر جو هر قدم استعمال ٿيل ٽيمپليٽ ۽ پرائمر سيٽ لاءِ بهتر ڪيو وڃي.اهو چڪر لڳ ڀڳ 20-40 ڀيرا ورجايو ويندو آهي، ۽ پوءِ وڌايل پروڊڪٽ جو تجزيو ڪري سگهجي ٿو، عام طور تي ايگرز جيل (تصوير 2).

جيئن ته پي سي آر هڪ انتهائي حساس طريقو آهي ۽ هڪ رد عمل لاءِ تمام گهٽ مقدار جي ضرورت هوندي آهي، ڪيترن ئي رد عملن لاءِ ماسٽر ميڪس تيار ڪرڻ جي سفارش ڪئي وئي آهي.ماسٽر ميڪس کي چڱي طرح ملايو وڃي ۽ پوءِ رد عمل جي تعداد جي حساب سان ورهايو وڃي، ان ڳالهه کي يقيني بڻايو وڃي ته هر ردعمل ۾ ساڳي مقدار ۾ اينزيم، ڊي اين ٽي پيز ۽ پرائمر شامل هوندا.ڪيترائي سپلائر، جهڙوڪ اينزو لائف سائنسز، پڻ پيش ڪن ٿا PCR ميڪس جيڪي اڳ ۾ ئي سڀ ڪجهه شامل آهن سواء پرائمر ۽ ڊي اين اي ٽيمپليٽ.

Guanine/Cytosine-rich (GC-rich) علائقا معياري PCR ٽيڪنالاجي ۾ هڪ چئلينج جي نمائندگي ڪن ٿا.GC سان مالا مال ترتيبون هيٺين GC مواد سان ترتيبن کان وڌيڪ مستحڪم آھن.ان کان علاوه، GC-rich sequences ۾ ثانوي ڍانچي ٺاھڻ جو رجحان ھوندو آھي، جھڙوڪ hairpin loops.نتيجي طور، GC-rich Double strands مڪمل طور تي الڳ ڪرڻ ڏکيو آهي denaturation مرحلي دوران.نتيجي طور، ڊي اين اي پوليمريز بغير ڪنهن رڪاوٽ جي نئين اسٽينڊ کي گڏ نه ٿو ڪري سگهي.هڪ اعلي denaturation گرمي پد هن کي بهتر ڪري سگهي ٿو، ۽ هڪ اعلي annealing گرمي پد ۽ ننڍو annealing وقت جي ترتيبن GC-rich پرائمر جي غير مخصوص پابند کي روڪي سگهي ٿو.اضافي ريگينٽس GC-امير ترتيبن جي واڌاري کي وڌائي سگھي ٿو.DMSO، گليسرول، ۽ بيٽين ثانوي جوڙجڪ کي ٽوڙڻ ۾ مدد ڪن ٿيون جيڪي GC رابطي جي سبب بڻجن ٿيون ۽ ان سان گڏ ٻٻرن جي علحدگي کي آسان بڻائي ٿي.

گرم شروع PCR

غير مخصوص واڌارو هڪ مسئلو آهي جيڪو پي سي آر جي دوران ٿي سگهي ٿو.اڪثر ڊي اين اي پوليميراسز جيڪي پي سي آر لاءِ استعمال ٿين ٿيون، بهترين ڪم ڪن ٿيون گرمي پد تي 68 ° C کان 72 ° C.بهرحال، اينزيم گهٽ درجه حرارت تي پڻ سرگرم ٿي سگهي ٿو، جيتوڻيڪ گهٽ درجي تائين.annealing جي درجه حرارت کان تمام گھٽ درجه حرارت تي، پرائمر غير خاص طور تي پابند ڪري سگھن ٿا ۽ غير مخصوص ايمپليفڪيشن جي اڳواڻي ڪري سگھن ٿا، جيتوڻيڪ ردعمل برف تي قائم ڪيو وڃي.ان کي پوليميرس انبائيٽرز استعمال ڪندي روڪيو وڃي ٿو جيڪي ڊي اين اي پوليمريز کان الڳ ٿين ٿا صرف هڪ ڀيرو هڪ خاص درجه حرارت تي پهچي وڃي، ان ڪري اصطلاح گرم شروع PCR.روڪيندڙ هڪ اينٽي باڊي ٿي سگهي ٿو جيڪو پوليميرس ۽ ڊينيچرز کي ابتدائي ڊينيچريشن جي گرمي پد (عام طور تي 95 ° C) تي پابند ڪري ٿو.

هاء فڊيليٽي پوليميرس

جڏهن ته ڊي اين اي پوليميراسيز اصل ٽيمپليٽ جي ترتيب کي بلڪل صحيح طور تي وڌائين ٿا، نيوڪليوٽائيڊ جي ميلاپ ۾ غلطيون ٿي سگهن ٿيون.ايپليڪيشنن ۾ بي ميلاپ جهڙوڪ ڪلوننگ جي نتيجي ۾ ٿي سگهي ٿي ٽرنڪٽ ٿيل ٽرانسڪرپٽس، ۽ غلط ترجمو ٿيل يا غير فعال پروٽينس هيٺ.انهن بي ترتيبن کان بچڻ لاءِ، پوليمراسز کي ”پروف ريڊنگ“ سرگرمي سان سڃاڻپ ۽ ڪم فلو ۾ شامل ڪيو ويو آهي.پهريون پروف ريڊنگ پوليميرس، Pfu، 1991 ۾ Pyrococcus furiosus ۾ سڃاڻپ ڪيو ويو.هن Pfu اينزيم ۾ 3 'کان 5' exonuclease سرگرمي آهي.جيئن ته ڊي اين اي کي وڌايو ويندو آهي، ايڪسونوڪليز بي ترتيب واري نيوڪليوٽائڊس کي هٽائي ٿو 3 جي آخر ۾.صحيح nucleotide پوء تبديل ڪيو ويو آهي، ۽ DNA جي جوڙجڪ جاري آهي.غلط nucleotide تسلسل جي سڃاڻپ اينزيم سان صحيح nucleoside triphosphate لاء پابند لاڳاپي تي مبني آهي، جتي غير موثر بائنڊنگ جي جوڙجڪ کي سست ڪري ٿو ۽ صحيح متبادل جي اجازت ڏئي ٿو.Pfu پوليمريز جي پروف ريڊنگ سرگرمي آخري تسلسل ۾ Taq DNA پوليمريز جي مقابلي ۾ گهٽ غلطين جي نتيجي ۾.تازن سالن ۾، ٻين پروف ريڊنگ اينزائمز جي نشاندهي ڪئي وئي آهي، ۽ ڊي اين اي ايمپليفڪيشن دوران غلطي جي شرح کي وڌيڪ گهٽائڻ لاءِ اصل Pfu اينزائم ۾ ترميمون ڪيون ويون آهن.

RT-PCR

ريورس ٽرانسڪرپشن PCR، يا RT-PCR، آر اين اي کي ٽيمپليٽ طور استعمال ڪرڻ جي اجازت ڏئي ٿو.هڪ اضافي قدم آر اين اي کي ڳولڻ ۽ وڌائڻ جي اجازت ڏئي ٿو.آر اين اي کي ريورس ٽرانسڪرپٽ استعمال ڪندي مڪمل ڪندڙ ڊي اين اي (سي ڊي اين اي) ۾ نقل ڪيو ويو آهي.آر اين اي ٽيمپليٽ جي معيار ۽ پاڪائي RT-PCR جي ڪاميابي لاءِ ضروري آهي.RT-PCR جو پهريون قدم هڪ DNA/RNA هائبرڊ جو ٺهيل آهي.ريورس ٽرانسڪرپٽ ۾ پڻ هڪ RNase H فنڪشن آهي، جيڪو هائبرڊ جي آر اين اي حصي کي خراب ڪري ٿو.ان کان پوءِ اڪيلائيءَ وارو ڊي اين اي ماليڪيول مڪمل ڪيو ويندو آهي ڊي اين اي-انحصار ڊي اين اي پوليمريز سرگرمي ذريعي ريورس ٽرانسڪرپيس جي سي ڊي اين اي ۾.پهرين-اسٽينڊ ردعمل جي ڪارڪردگي تي اثر انداز ٿي سگھي ٿو amplification عمل.ھتان کان، معياري پي سي آر جو طريقو استعمال ڪيو ويندو آھي سي ڊي اين اي کي وڌائڻ لاء.RT-PCR ذريعي آر اين اي کي سي ڊي اين اي ۾ واپس آڻڻ جا ڪيترائي فائدا آهن، ۽ اهو بنيادي طور تي جين اظهار جي تجزيي لاءِ استعمال ٿيندو آهي.آر اين اي سنگل اسٽرينڊ ۽ تمام غير مستحڪم آهي، جيڪو ان سان ڪم ڪرڻ مشڪل بڻائي ٿو.اهو عام طور تي qPCR ۾ پهريون قدم طور ڪم ڪري ٿو، جيڪو آر اين اي ٽرانسڪرپشن کي حياتياتي نموني ۾ مقدار ڏئي ٿو.

qPCR ۽ RT-qPCR

مقداري پي سي آر (qPCR) ڪيترن ئي ايپليڪيشنن لاءِ نيوڪليڪ ايسڊس کي ڳولڻ، خاصيت ۽ مقدار کي طئي ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي.RT-qPCR ۾، آر اين اي ٽرانسڪرپٽس اڪثر ڪري انهن کي ريورس ٽرانسڪرپشن ذريعي سي ڊي اين اي ۾ پهريون ڀيرو، جيئن مٿي بيان ڪيو ويو آهي، ۽ پوء qPCR بعد ۾ ڪيو ويندو آهي.جيئن معياري پي سي آر ۾، ڊي اين اي کي ٽن ورجائي مرحلا ذريعي وڌايو ويندو آهي: ڊنيٽوريشن، اينيلنگ، ۽ ايلنگيشن.بهرحال، qPCR ۾، فلورسنٽ ليبلنگ ڊيٽا گڏ ڪرڻ جي قابل بنائي ٿي جيئن PCR ترقي ڪري ٿي.هن ٽيڪنڪ ۾ موجود طريقن ۽ ڪيمسٽري جي رينج جي ڪري ڪيترائي فائدا آهن.

رنگ جي بنياد تي qPCR (عام طور تي سائو) ۾، فلورسنٽ ليبلنگ dsDNA بائنڊنگ ڊائي جي استعمال سان ايمپليفائيڊ ڊي اين اي ماليڪيولز جي مقدار کي درست ڪرڻ جي اجازت ڏئي ٿي.هر چڪر دوران، فلوروسنس ماپي ويندي آهي.fluorescence سگنل نقل ٿيل ڊي اين اي جي مقدار جي تناسب سان وڌي ٿو.انهيءَ ڪري، ڊي اين اي کي ”حقيقي وقت“ (Fig. 3) ۾ مقدار ۾ طئي ڪيو ويندو آهي.رنگ جي بنياد تي qPCR جا نقصان هي آهن ته هڪ وقت ۾ صرف هڪ ٽارگيٽ کي جانچي سگهجي ٿو ۽ اهو رنگ ڪنهن به نموني ۾ موجود ds-DNA سان جڙيل هوندو.

تحقيق جي بنياد تي qPCR ۾، ڪيترن ئي هدفن کي هر نموني ۾ هڪ ئي وقت ڳولي سگهجي ٿو، پر ان لاءِ پرائمر کان علاوه استعمال ٿيل ٽارگيٽ-مخصوص پروب جي اصلاح ۽ ڊيزائن جي ضرورت آهي.ڪيترن ئي قسمن جي تحقيقاتي ڊيزائن موجود آهن، پر سڀ کان وڌيڪ عام قسم هڪ هائڊروليسس پروب آهي، جنهن ۾ فلوروفور ۽ quencher شامل آهن.فلورسنس گونج انرجي ٽرانسفر (FRET) فلوروفور جي اخراج کي روڪي ٿو quencher ذريعي جڏهن ته تحقيق برقرار آهي.جڏهن ته، پي سي آر جي رد عمل جي دوران، پرائمر جي توسيع جي دوران، پروب کي هائيڊولائيز ڪيو ويو آهي ۽ مخصوص ترتيب کي وڌائڻ جي پابند آهي.پروب جي ڇنڊڇاڻ فلوروفور کي quencher کان جدا ڪري ٿي ۽ نتيجي ۾ فلوروسينس ۾ واڌ تي منحصر واڌارو ٿئي ٿو (تصوير 4).اهڙيء طرح، هڪ تحقيق جي بنياد تي qPCR ردعمل مان فلورسنس سگنل نموني ۾ موجود تحقيق جي حدف جي ترتيب جي مقدار جي تناسب آهي.ڇاڪاڻ ته تحقيق جي بنياد تي qPCR رنگ جي بنياد تي qPCR کان وڌيڪ مخصوص آهي، اهو اڪثر ڪري ٽيڪنالوجي آهي qPCR تي ٻڌل تشخيصي اسيسس ۾ استعمال ڪيو ويندو آهي.

Isothermal Amplification

مٿي ذڪر ڪيل پي سي آر ٽيڪنالاجي کي قيمتي thermocycling سامان جي ضرورت آهي صحيح طور تي ڊينيچريشن، اينيلنگ، ۽ واڌ جي مرحلن لاء چيمبر جي درجه حرارت کي صحيح طور تي ريمپ ڪرڻ لاء.ڪيتريون ئي ٽيڪنڪون ترقي ڪيون ويون آهن جيڪي اهڙين صحيح ڊوائيسز جي ضرورت نه هونديون آهن ۽ هڪ سادي پاڻي جي غسل ۾ يا دلچسپي جي سيلز جي اندر پڻ ڪري سگهجي ٿو.انهن ٽيڪنالاجي کي مجموعي طور تي isothermal amplification سڏيو ويندو آهي ۽ ڪم جي بنياد تي exponential, linear, or cascade amplification.

isothermal amplification جو سڀ کان مشهور قسم لوپ-ثالث isothermal amplification يا LAMP آهي.LAMP ٽيمپليٽ ڊي اين اي يا آر اين اي کي وڌائڻ لاءِ 65⁰C تي exponential amplification استعمال ڪري ٿو.LAMP کي انجام ڏيڻ وقت، ٽارگيٽ ڊي اين اي جي علائقن جي مڪمل طور تي چار کان ڇهه پرائمر نئين ڊي اين اي کي گڏ ڪرڻ لاءِ ڊي اين اي پوليمريز سان استعمال ڪيا ويندا آهن.انهن مان ٻه پرائمر تعظيم واري ترتيب آهن جيڪي ٻين پرائمر ۾ ترتيبن کي سڃاڻيندا آهن ۽ انهن کي پابند ڪندا آهن، نئين ٺهيل ڊي اين اي ۾ "لوپ" جي جوڙجڪ جي اجازت ڏئي ٿي جيڪا پوء پرائمر اينيلنگ کي اڳتي وڌڻ جي ايندڙ دورن ۾ مدد ڪري ٿي.LAMP ڪيترن ئي طريقن سان ڏسي سگھجي ٿو، بشمول فلورسنس، ايگرز جيل الیکٹروفورسس، يا رنگيميٽري.رنگيميٽري ذريعي پراڊڪٽ جي موجودگي يا غير موجودگي کي ڏسڻ ۽ معلوم ڪرڻ جي آسانيءَ ۽ گهربل قيمتي سامان جي کوٽ LAMP کي SARS-CoV-2 جي جاچ لاءِ مناسب آپشن بنايو انهن علائقن ۾ جتي ڪلينڪل ليب ٽيسٽنگ آساني سان دستياب نه هئي، يا نمونن جي اسٽوريج ۽ ٽرانسپورٽ ممڪن نه هو، يا ليبارٽرين ۾ جن وٽ اڳ ۾ پي سي آر ٿرمو سائيڪلنگ جو سامان نه هو.