1. بنيادي ڄاڻ (جيڪڏهن توهان تجرباتي حصو ڏسڻ چاهيو ٿا، مهرباني ڪري سڌو سنئون ٻئي حصي ڏانهن منتقل ڪريو)

روايتي پي سي آر جي نڪتل رد عمل جي طور تي، حقيقي وقت پي سي آر بنيادي طور تي پي سي آر ايمپليفڪيشن جي رد عمل جي هر چڪر ۾ ايمپليفڪيشن پراڊڪٽ جي مقدار جي تبديلي کي حقيقي وقت ۾ فلوروسينس سگنل جي تبديلي جي ذريعي مانيٽر ڪري ٿو، ۽ ct قدر ۽ معياري وکر جي وچ ۾ تعلق ذريعي شروعاتي ٽيمپليٽ کي مقداري طور تي تجزيو ڪري ٿو.

RT-PCR جي مخصوص ڊيٽا آهنبيس لائين, fluorescence حد۽سي ٽي قدر.

RT-PCR لاءِ عام ليبلنگ جا طريقا:

2. تجرباتي قدم

2.1 تجرباتي گروپ جي باري ۾- گروپ ۾ ڪيترائي کوهه هجڻ گهرجن، ۽ اتي حياتياتي ورجائي هجڻ گهرجي.

2.2 پرائمر ڊيزائن جا اصول

①SiRNA نسلن لاءِ مخصوص آهي، ۽ مختلف نسلن جا سلسلا مختلف هوندا.

②SiRNA منجمد خشڪ پائوڊر ۾ پيڪ ٿيل آهي، جنهن کي ڪمري جي حرارت تي 2-4 هفتن تائين مستحڪم طور تي محفوظ ڪري سگهجي ٿو.

2.3 اوزار يا ريجنٽ جيڪي اڳ ۾ تيار ٿيڻ گهرجن

2.4 مسئلن جي حوالي سان جن کي خاص تجرباتي مرحلن ۾ ڌيان ڏيڻ جي ضرورت آهي:

①siRNA منتقلي جو عمل

1. پليٽنگ لاءِ، توھان 24-ڪھڙي پليٽ، 12-ڪھڙي پليٽ يا 6-ڪھڙي پليٽ چونڊي سگھو ٿا (24-ڪھڙي پليٽ جي ھر کوھ ۾ تجويز ڪيل سراسري RNA ڪنسنٽريشن اٽڪل 100-300 ng/uL آھي)، ۽ سيلز جي بھترين منتقلي جي کثافت 60٪ -80٪ ​​تائين آھي.

2. منتقلي جا مرحلا ۽ مخصوص گهرجن سختي سان هدايتن جي مطابق آهن.

3. منتقلي کان پوءِ، نمونا گڏ ڪري سگهجن ٿا 24-72 ڪلاڪن اندر mRNA جي چڪاس (RT-PCR) يا پروٽين جي چڪاس لاءِ 48-96 ڪلاڪن اندر (WB)

② آر اين اي ڪڍڻ وارو عمل

1. exogenous enzymes ذريعي آلودگي کي روڪڻ.ان ۾ خاص طور تي ماسڪ پائڻ ۽ دستانو سختي سان شامل آهن؛sterilized pipette ٽپس ۽ EP ٽيوب استعمال ڪندي؛تجربو ۾ استعمال ٿيل پاڻي RNase-Free هجڻ گهرجي.

2. ان کي ٻه ڀيرا ڪرڻ جي صلاح ڏني وئي آهي جيئن جلدي ڪڍڻ واري کٽ ۾ تجويز ڪيل آهي، جيڪا حقيقت ۾ پاڪائي ۽ پيداوار کي بهتر بڻائي سگهندي.

3. فضول مايع کي آر اين اي ڪالم کي ڇهڻ نه گهرجي.

③ آر اين اي جي مقدار

آر اين اي ڪڍڻ کان پوء، ان کي سڌو سنئون نانوڊروپ سان مقدار ڪري سگهجي ٿو، ۽ گهٽ ۾ گهٽ پڙهڻ 10ng / ul جيترو ٿي سگهي ٿو.

④ ريورس ٽرانسپشن عمل

1. RT-qPCR جي اعليٰ حساسيت جي ڪري، هر نموني لاءِ گهٽ ۾ گهٽ 3 متوازي کوهه ٺاهڻ گهرجن ته جيئن پوءِ ايندڙ Ct کي تمام گهڻو مختلف ٿيڻ کان روڪيو وڃي يا شمارياتي تجزيي لاءِ SD تمام وڏو نه ٿئي.

2. ماسٽر ميڪس کي بار بار منجمد نه ڪريو ۽ ٿڪايو.

3. هر ٽيوب/سوراخ کي نئين ٽپ سان تبديل ڪيو وڃي!نموني شامل ڪرڻ لاءِ مسلسل ساڳي پائيپٽ ٽپ استعمال نه ڪريو!

4. نموني کي شامل ڪرڻ کان پوء 96-سٺي پليٽ سان ڳنڍيل فلم کي پليٽ سان هموار ڪرڻ جي ضرورت آهي.ان کي مشين تي رکڻ کان اڳ سينٽرفيوج ڪرڻ بهتر آهي، ته جيئن ٽيوب جي ڀت تي مائع هيٺ وهي سگهي ۽ هوائي بلبلز کي هٽائي.

⑤ عام وکر جو تجزيو

2.5 ڊيٽا جي تجزيو بابت

qPCR جي ڊيٽا تجزيي کي ورهائي سگهجي ٿو لاڳاپو مقدار ۽ مطلق مقدار ۾.مثال طور، علاج گروپ ۾ سيلز ڪنٽرول گروپ ۾ سيلز جي مقابلي ۾،

ايڪس جين جي ايم آر اين اي ڪيترا ڀيرا تبديل ٿي، اهو نسبتا مقدار آهي؛سيلز جي هڪ خاص تعداد ۾، ايڪس جين جو mRNA

ڪيتريون ئي ڪاپيون آهن، اهو مطلق مقدار آهي.عام طور تي جيڪو اسان ليبارٽري ۾ تمام گهڻو استعمال ڪندا آهيون اهو نسبتا مقدار وارو طريقو آهي.عام طور تي،2-ΔΔct طريقوتجربن ۾ سڀ کان وڌيڪ استعمال ڪيو ويندو آهي، تنهنڪري صرف اهو طريقو هتي تفصيل سان متعارف ڪرايو ويندو.

2-ΔΔct طريقو: حاصل ڪيل نتيجو تجرباتي گروپ ۾ ٽارگيٽ جين جي اظهار ۾ فرق آهي ڪنٽرول گروپ ۾ ٽارگيٽ جين جي نسبت.اهو ضروري آهي ته ٽارگيٽ جين ۽ اندروني ريفرنس جين ٻنهي جي افاديت جي افاديت 100٪ جي ويجهو هجي، ۽ لاڳاپا انحراف 5٪ کان وڌيڪ نه هجڻ گهرجي.

حساب ڪتاب جو طريقو هن ريت آهي:

Δct ڪنٽرول گروپ = ڪنٽرول گروپ ۾ ٽارگيٽ جين جو سي ٽي قدر - ڪنٽرول گروپ ۾ اندروني ريفرنس جين جو سي ٽي قدر

Δct تجرباتي گروپ = تجرباتي گروپ ۾ ٽارگيٽ جين جو ct قدر - تجرباتي گروپ ۾ اندروني ريفرنس جين جو ct قدر

ΔΔct = Δct تجرباتي گروپ-Δct ڪنٽرول گروپ

آخر ۾، اظهار جي سطح ۾ فرق جي گھڻن جو حساب ڪريو:

Fold = 2-ΔΔct تبديل ڪريو (ايڪسل فنڪشن سان لاڳاپيل پاور پاور آهي)

لاڳاپيل مصنوعات:

سيل سڌو RT-qPCR کٽ