一، ردعمل سسٽم جي حساسيت کي وڌايو:

1. اعلي معيار آر اين اي کي الڳ ڪريو:

ڪامياب سي ڊي اين اي جي جوڙجڪ اعلي معيار جي آر اين اي مان اچي ٿي.اعلي معيار جي آر اين اي کي گهٽ ۾ گهٽ مڪمل ڊگھائي هجڻ گهرجي ۽ ريورس ٽرانسڪرپٽ انبائيٽرز جهڙوڪ EDTA يا SDS کان پاڪ هجڻ گهرجي.آر اين اي جو معيار ترتيب ڏئي ٿو وڌ ۾ وڌ مقدار جي معلومات جيڪا توهان سي ڊي اين اي ۾ نقل ڪري سگهو ٿا.ھڪڙو عام آر اين اي صاف ڪرڻ جو طريقو ھڪڙو قدم طريقو آھي جيڪو guanidine isothiocyanate / acid phenol استعمال ڪندي آھي.RNase جي مقدار کي نشانو بڻائڻ سان آلودگي کي روڪڻ لاءِ، RNase سان مالا مال نمونن (جهڙوڪ پينڪرياز) کان الڳ ٿيل RNA کي اعليٰ معيار جي RNA کي محفوظ ڪرڻ لاءِ، خاص ڪري ڊگھي مدي واري اسٽوريج لاءِ formaldehyde ۾ ذخيرو ڪرڻ جي ضرورت آهي.چوهيءَ جي جگر مان نڪتل آر اين اي بنيادي طور تي هڪ هفتي تائين پاڻيءَ ۾ رکڻ کان پوءِ خراب ٿي ويو، جڏهن ته چوهيءَ جي تلي مان نڪتل RNA 3 سالن تائين پاڻيءَ ۾ رکڻ کانپوءِ مستحڪم رهي.ان کان علاوه، 4 kb کان وڌيڪ ڊگھي ٽرانسڪرپٽس ننڍي ٽرانسڪرپشن جي ڀيٽ ۾ ٽريس RNases ذريعي تباهي لاءِ وڌيڪ حساس هونديون آهن.ذخيرو ٿيل آر اين اي نموني جي استحڪام کي وڌائڻ لاء، آر اين اي کي ڊائيونائيز فارمامائيڊ ۾ ڦهلائي سگهجي ٿو ۽ محفوظ ڪري سگهجي ٿو -70 ° C.آر اين اي کي محفوظ ڪرڻ لاءِ استعمال ٿيندڙ فارمامائيڊ لازمي طور تي آر اين اي جي خراب ٿيڻ واري ملبي کان پاڪ هجي.پينڪرياز مان آر اين اي فارمامائيڊ ۾ گهٽ ۾ گهٽ هڪ سال تائين محفوظ ڪري سگهجي ٿو.جڏهن آر اين اي استعمال ڪرڻ جي تياري ڪري رهيا آهيو، توهان هيٺ ڏنل طريقو استعمال ڪري سگهو ٿا آر اين اي کي تيز ڪرڻ لاءِ: NaCl کي 0.2M ۽ 4 ڀيرا ايٿانول جي مقدار ۾ شامل ڪريو، ڪمري جي حرارت تي 3-5 منٽن لاءِ رکو، ۽ 5 منٽن لاءِ 10,000×g تي سينٽرفيوج ڪريو.

2. استعمال ڪريو RNaseH-inactive (RNaseH-) ريورس ٽرانسڪرپٽ:

RNase inhibitors اڪثر شامل ڪيا ويندا آھن ريورس ٽرانسڪرپشن رد عمل کي وڌائڻ لاءِ سي ڊي اين اي ٺاھڻ جي ڊگھائي ۽ پيداوار کي.RNase inhibitors کي پهرين-strand synthesis Reaction دوران بفر ۽ Reducing agent (جهڙوڪ DTT) جي موجودگيءَ ۾ شامل ڪيو وڃي، ڇاڪاڻ ته cDNA سنٿيسس کان اڳ وارو عمل انابيٽر کي رد ڪري ٿو، ان ڪري پابند RNase جاري ڪري ٿو جيڪو RNA کي خراب ڪري سگھي ٿو.پروٽين RNase inhibitors صرف RNase A, B, C ذريعي RNA جي تباهي کي روڪيندا آهن ۽ چمڙي تي RNase کي نه روڪيندا آهن، تنهن ڪري محتاط رهو ته انهن inhibitors جي استعمال جي باوجود توهان جي آڱرين مان RNase متعارف نه ڪرايو.

ريورس ٽرانسڪرپٽس آر اين اي کي سي ڊي اين اي ۾ تبديل ڪري ٿو.ٻئي M-MLV ۽ AMV انهن جي پنهنجي پوليمريز سرگرمي کان علاوه آر اين ايس ايڇ سرگرميون آهن.RNaseH سرگرمي ۽ پوليميرس سرگرمي هڪ ٻئي سان مقابلو ڪن ٿا هائبرڊ اسٽرينڊ لاءِ جيڪي آر اين اي ٽيمپليٽ ۽ ڊي اين اي پرائمر يا سي ڊي اين اي ايڪسٽينشن اسٽرينڊ جي وچ ۾ ٺهيل آهن، ۽ آر اين اي: ڊي اين اي ڪمپليڪس ۾ آر اين اي اسٽرينڊ کي خراب ڪن ٿيون.آر اين اي ٽيمپليٽ RNaseH سرگرمي جي ڪري خراب ٿي ويو آهي، سي ڊي اين اي جي جوڙجڪ لاء هڪ مؤثر سبسٽريٽ جي طور تي ڪم نٿو ڪري سگهي، جيڪا سي ڊي اين اي جي جوڙجڪ جي پيداوار ۽ ڊيگهه کي گھٽائي ٿي.تنهن ڪري، اهو فائدو ٿيندو ته ريورس ٽرانسڪرپٽ جي RNaseH سرگرمي کي ختم ڪرڻ يا تمام گهڻو گھٽائڻ.

SuperScript Ⅱ ريورس ٽرانسڪرپٽ، RNaseH- MMLV ريورس ٽرانسڪرپٽ ۽ ThermoScript ريورس ٽرانسڪرپٽ، RNaseH- AMV، MMLV ۽ AMV کان وڌيڪ مقدار ۽ وڌيڪ مڪمل ڊگھي cDNA حاصل ڪري سگھن ٿا.RT-PCR حساسيت متاثر ٿيندي cDNA جي مقدار جي ترتيب سان.ThermoScript AMV کان گهڻو وڌيڪ حساس آهي.RT-PCR پروڊڪٽس جي ماپ محدود هوندي آهي ريورس ٽرانسڪرپٽيز جي قابليت جي ڪري سي ڊي اين اي کي ٺهڪائڻ لاءِ، خاص ڪري جڏهن وڏن سي ڊي اين ايز کي ڪلون ڪرڻ.MMLV جي مقابلي ۾، SuperScripⅡ خاص طور تي ڊگھي RT-PCR پروڊڪٽس جي پيداوار کي وڌايو.RNaseH-reverse transcriptase پڻ thermostability کي وڌايو آهي، تنهنڪري رد عمل عام 37-42 ° C کان وڌيڪ گرمي پد تي ڪري سگهجي ٿو.تجويز ڪيل تجزيي جي حالتن جي تحت، oligo(dT) پرائمر ۽ 10 μCi جو [α-P]dCTP استعمال ڪريو.پهرين اسٽينڊ جي مجموعي پيداوار کي TCA ورن جي طريقي سان استعمال ڪيو ويو.مڪمل ڊگھي سي ڊي اين جي تجزيو ڪيو ويو سائيز جي ترتيب ڏنل بينڊ استعمال ڪندي ۽ ڳڻيو ويو الڪائن ايگرز جيل تي.

3. ريورس ٽرانسپشن لاءِ انڪيوبيشن جي گرمي پد کي وڌايو:

هڪ اعلي انڪوبيشن درجه حرارت آر اين اي ثانوي ڍانچي کي کولڻ ۾ مدد ڪري ٿو، رد عمل جي پيداوار کي وڌائي ٿو.اڪثر آر اين اي ٽيمپليٽس لاءِ، آر اين اي ۽ پرائمر کي 65°C تي بفر يا لوڻ کان سواءِ انڪيوب ڪرڻ سان، برف تي تيز ٿڌي ٿيڻ سان اڪثر ثانوي ڍانچي کي ختم ڪري ڇڏيندو ۽ پرائمر کي پابند ڪرڻ جي اجازت ڏيندو.بهرحال، ڪجهه ٽيمپليٽس اڃا تائين ثانوي جوڙجڪ آهن، جيتوڻيڪ گرمي جي خراب ٿيڻ کان پوء.انهن مشڪل ٽيمپليٽس جي ايمپليفڪيشن کي استعمال ڪري سگهجي ٿو ThermoScript Reverse Transcriptase ۽ ريورس ٽرانسڪرپشن رد عمل کي وڌيڪ درجه حرارت تي رکڻ لاءِ ايمپليفڪيشن کي بهتر ڪرڻ لاءِ.اعليٰ انڪوبيشن گرمي پد به خاصيت وڌائي سگھي ٿو، خاص طور تي جڏھن جين-مخصوص پرائمر (GSP) سي ڊي اين اي جي ٺاھڻ لاءِ استعمال ڪيا وڃن (ڏسو باب 3).جيڪڏهن GSP استعمال ڪري رهيا آهيو، پڪ ڪريو ته پرائمر جو Tm متوقع انڪيوبيشن جي درجه حرارت جي برابر آهي.oligo(dT) ۽ 60°C کان مٿي بي ترتيب پرائمر استعمال نه ڪريو.رينڊم پرائمر کي 10 منٽن لاءِ 25°C تي انڪيوبيشن جي ضرورت پوندي آهي ان کان اڳ 60°C تائين وڌي وڃي.وڌيڪ ريورس ٽرانسڪرپشن جي درجه حرارت کي استعمال ڪرڻ کان علاوه، خاصيت کي سڌو سنئون آر اين اي/پرائمر ميڪس کي 65 ° سي ڊينيچريشن جي درجه حرارت کان ريورس ٽرانسڪرپشن انڪيوبيشن گرمي پد ڏانهن منتقل ڪندي ۽ اڳ-گرم 2× رد عمل جو مرکب شامل ڪرڻ سان پڻ بهتر ٿي سگهي ٿو (cDNA گرم-شروع سنٿيسس).اهو طريقو انٽرموليڪولر بنيادي جوڙي کي روڪڻ ۾ مدد ڪري ٿو جيڪو گهٽ درجه حرارت تي ٿئي ٿو.RT-PCR لاءِ گھربل ڪيترن ئي درجه حرارت جي سوئچنگ کي تھرمل سائيڪلر استعمال ڪندي آسان بڻائي سگھجي ٿو.

Tth Thermostable polymerase Mg2+ جي موجودگيءَ ۾ DNA پوليمريز ۽ Mn2+ جي موجودگيءَ ۾ RNA پوليمريز جي طور تي ڪم ڪري ٿو.اهو 65 ° C جي وڌ ۾ وڌ گرمي پد تي گرم رکي سگهجي ٿو.جڏهن ته، PCR دوران Mn2+ جي موجودگي وفاداري کي گھٽائي ٿي، جيڪا Tth پوليمريز کي اعلي صحت واري ايمپليفڪيشن لاءِ گهٽ موزون بڻائي ٿي، جهڙوڪ سي ڊي اين اي جي ڪلوننگ.ان کان علاوه، Tth ۾ گھٽ ريورس ٽرانسپشن ڪارڪردگي آھي، جيڪا حساسيت کي گھٽائي ٿي، ۽، ريورس ٽرانسپشن ۽ پي سي آر ھڪڙي اينزيم سان انجام ڏئي سگھجن ٿيون، ريورس ٽرانسپشن کان سواء ڪنٽرول ردعمل استعمال نه ٿي سگھن ٿيون سي ڊي اين اي ايمپليفڪيشن پروڊڪٽس کي جينومڪ ڊي اين اي کي آلودگي سان موازنہ ڪرڻ لاء.amplification جي شين کي الڳ ڪيو ويو.

4. اضافو جيڪي ريورس ٽرانسپشن کي فروغ ڏين ٿا:

گليسرول ۽ ڊي ايم ايس او سميت اضافي شيون فرسٽ اسٽرينڊ سنٿيسس رد عمل ۾ شامل ڪيون وينديون آهن، جيڪي نيوڪليڪ ايسڊ ڊبل اسٽرينڊ جي استحڪام کي گهٽائي سگهن ٿيون ۽ آر اين اي جي ثانوي ساخت کي ختم ڪري سگهن ٿيون.سپر اسڪرپٽ II يا MMLV سرگرمي کي متاثر ڪرڻ کان سواءِ 20٪ گليسرول يا 10٪ DMSO شامل ڪري سگھجي ٿو.AMV سرگرمي جي نقصان کان سواء 20٪ گليسرول تائين برداشت ڪري سگھي ٿو.سپر اسڪرپٽ Ⅱ ريورس ٽرانسڪرپشن رد عمل ۾ RT-PCR جي حساسيت کي وڌائڻ لاءِ، 10% گليسرول شامل ڪري سگھجي ٿو ۽ 45 ° C تي انڪيوبيٽ ڪري سگھجي ٿو.جيڪڏهن 1/10 ريورس ٽرانسڪرپشن رد عمل جي پيداوار پي سي آر ۾ شامل ڪئي وئي آهي، پوء ايمپليفڪيشن رد عمل ۾ گليسرول جو تسلسل 0.4٪ آهي، جيڪو پي سي آر کي روڪڻ لاء ڪافي ناهي.

5. RNaseH علاج:

PCR کان اڳ RNaseH سان سي ڊي اين جي تجزيي جي رد عمل جو علاج حساسيت کي وڌائي سگھي ٿو.ڪجهه ٽيمپليٽس لاءِ، اهو سوچيو ويو آهي ته آر اين اي سي ڊي اين اي جي تجزيي جي رد عمل ۾ امپليفڪيشن پروڊڪٽس جي پابند ٿيڻ کان روڪي ٿي، ان صورت ۾ آر اين اي ايڇ علاج سان حساسيت وڌائي سگھي ٿي.عام طور تي، RNaseH علاج ضروري آھي جڏھن ڊگھي پوري ڊگھي cDNA ھدف واري ٽيمپليٽس کي وڌايو وڃي، جھڙوڪ گھٽ-ڪاپي ٽيوبرس شيروسس II.ھن مشڪل ٽيمپليٽ لاءِ، RNaseH علاج سپر اسڪرپٽ II يا AMV-synthesized cDNA پاران پيدا ڪيل سگنل کي وڌايو.اڪثر RT-PCR رد عملن لاءِ، RNaseH علاج اختياري هوندو آهي، ڇاڪاڻ ته PCR denaturation قدم 95°C تي عام طور تي RNA:DNA ڪمپليڪس ۾ RNA کي هائيڊولائيز ڪري ٿو.

6. ننڍي آر اين اي جي چڪاس جو طريقو:

RT-PCR خاص طور تي مشڪل آهي جڏهن صرف ننڍي مقدار ۾ آر اين اي موجود آهن.Glycogen آر اين اي جي اڪيلائي دوران ڪيريئر جي طور تي شامل ڪيو ويو ننڍڙن نمونن جي پيداوار کي وڌائڻ ۾ مدد ڪري ٿي.RNase-free glycogen شامل ڪري سگھجي ٿو ساڳئي وقت Trizol شامل ڪرڻ سان.گلائڪوجن پاڻيءَ ۾ حل ٿيندڙ آهي ۽ آر اين اي سان گڏ پاڻيءَ واري مرحلي ۾ رکي سگهجي ٿو ته جيئن ايندڙ ورن ۾ مدد ڪري سگهجي.نمونن لاءِ 50 ملي گرام کان گھٽ ٽشو يا 106 ڪلچر ٿيل سيلز، RNase-free glycogen جي تجويز ڪيل ڪنسنٽريشن 250 μg/ml آهي.

سپر اسڪرپٽ II کي استعمال ڪندي ريورس ٽرانسپشن ردعمل ۾ ايڪٽيليٽيڊ BSA شامل ڪرڻ سان حساسيت وڌائي سگھي ٿي، ۽ RNA جي ننڍي مقدار لاءِ، SuperScript II جي مقدار کي گھٽائڻ ۽ RNaseOut nuclease inhibitor جي 40 يونٽن کي شامل ڪرڻ سان تشخيص جي سطح کي وڌائي سگھي ٿو.جيڪڏهن Glycogen استعمال ڪيو ويندو آهي آر اين اي اڪيلائيشن جي عمل ۾، اهو اڃا تائين سفارش ڪئي وئي آهي ته BSA يا RNase inhibitor شامل ڪريو جڏهن سپر اسڪرپٽ II استعمال ڪندي ريورس ٽرانسپشن ردعمل لاء.

二، RT-PCR جي خاصيت کي وڌايو

1. CND Asynthesis:

فرسٽ اسٽرينڊ سي ڊي اين اي جي ٺهڻ کي ٽن مختلف طريقن سان شروع ڪري سگهجي ٿو، جنهن جي لاڳاپي جي خاصيت سي ڊي اين اي جي مقدار ۽ قسم کي متاثر ڪري ٿي.

بي ترتيب پرائمر طريقو ٽن طريقن مان گھٽ ۾ گھٽ مخصوص ھو.پرائمر سڄي ٽرانسڪرپٽ ۾ ڪيترن ئي سائيٽن تي اينيل ڪري ٿو، مختصر، جزوي-لمبائي سي ڊي اين ايز ٺاهي ٿو.اهو طريقو اڪثر استعمال ڪيو ويندو آهي 5′ آخري ترتيبون حاصل ڪرڻ ۽ RNA ٽيمپليٽس مان سي ڊي اين اي حاصل ڪرڻ لاءِ ثانوي ڍانچي جي علائقن سان يا ختم ٿيڻ واري سائيٽن سان جن کي ريورس ٽرانسڪرپٽ ذريعي نقل نٿو ڪري سگهجي.سڀ کان ڊگھي سي ڊي اين اي حاصل ڪرڻ لاءِ، هر آر اين اي نموني ۾ پرائمر ۽ آر اين اي جو تناسب تجرباتي طور تي طئي ڪرڻو پوندو.بي ترتيب پرائمر جي شروعاتي ڪنسنٽريشن 50 کان 250 اين جي في 20 μl ردعمل جي حد تائين.جيئن ته بي ترتيب پرائمر استعمال ڪندي ڪل RNA مان ٺهيل cDNA بنيادي طور تي رائبوسومل RNA آهي، پولي(A)+RNA کي عام طور تي ٽيمپليٽ طور چونڊيو ويندو آهي.

اوليگو (ڊي ٽي) پرائمر بي ترتيب پرائمر کان وڌيڪ مخصوص آهن.اهو اڪثر يوڪريوٽڪ mRNAs جي 3′ پڇاڙيءَ ۾ مليل پولي (A) دم کي hybridize ڪري ٿو.ڇاڪاڻ ته پولي(اي)+ آر اين اي لڳ ڀڳ 1٪ کان 2٪ ڪل RNA جو آهي، سي ڊي اين اي جي مقدار ۽ پيچيدگي بي ترتيب پرائمر جي ڀيٽ ۾ تمام گهٽ آهي.ان جي اعلي خصوصيت جي ڪري، oligo (dT) عام طور تي آر اين اي جي تناسب کي پرائمر ۽ پولي (A) + چونڊ جي اصلاح جي ضرورت ناهي.اهو 0.5μg oligo (dT) في 20μl ردعمل سسٽم استعمال ڪرڻ جي صلاح ڏني وئي آهي.oligo(dT)12-18 اڪثر RT-PCR لاءِ موزون آهي.ThermoScript RT-PCR سسٽم oligo(dT)20 پيش ڪري ٿو ڇاڪاڻ ته ان جي بهتر حرارتي استحڪام جي ڪري وڌيڪ انڪيوبيشن گرمي پد لاءِ.

جيني مخصوص پرائمر (GSP) ريورس ٽرانسپشن قدم لاءِ سڀ کان وڌيڪ مخصوص پرائمر آھن.GSP هڪ antisense oligonucleotide آهي جيڪو خاص طور تي RNA ٽارگيٽ جي ترتيب کي هائبرڊائيز ڪري سگهي ٿو، برعڪس random primers يا oligo(dT)، جيڪو سڀني RNAs کي anneal ڪري ٿو.PCR پرائمر ڊزائين ڪرڻ لاءِ استعمال ٿيل ساڳيون قاعدا GSP جي ڊيزائن تي لاڳو ٿين ٿا ريورس ٽرانسپشن رد عمل ۾.GSP اهو ساڳيو سلسلو ٿي سگهي ٿو جيڪو ايمپليفڪيشن پرائمر جو آهي جيڪو ايم آر اين اي جي 3′-سڀ کان وڌيڪ پڇاڙيءَ کي اينيل ڪري ٿو، يا GSP کي ريورس ايمپليفڪيشن پرائمر جي هيٺان وهڪري کي انيل ڪرڻ لاءِ ڊزائين ڪري سگهجي ٿو.ڪجهه وسيع ڪيل مضمونن لاءِ، ڪامياب RT-PCR لاءِ هڪ کان وڌيڪ اينٽي سينس پرائمر ٺاهڻ جي ضرورت آهي ڇو ته ٽارگيٽ آر اين اي جي ثانوي ڍانچي شايد پرائمر بائنڊنگ کي روڪي سگهي ٿي.اهو 1 pmol antisense GSP استعمال ڪرڻ جي سفارش ڪئي وئي آهي 20 μl فرسٽ اسٽرينڊ سنٿيسس ردعمل ۾.

2. ريورس ٽرانسپشن لاءِ انڪيوبيشن جي گرمي پد کي وڌايو:

GSP خاصيت جي مڪمل فائدي جو پورو فائدو وٺڻ لاء، اعلي thermostability سان هڪ ريورس ٽرانسڪرپٽ استعمال ڪيو وڃي.Thermostable ريورس ٽرانسپيسس تيز گرمي پد تي incubated ڪري سگهجي ٿو ته جيئن رد عمل جي سختي کي وڌايو وڃي.مثال طور، جيڪڏهن هڪ GSP 55 ° C تي ڳنڍي ٿو، GSP جي خاصيت مڪمل طور تي استعمال نه ڪئي ويندي جيڪڏهن AMV يا M-MLV کي 37 ° C جي گهٽ سختي تي ريورس ٽرانسپشن لاءِ استعمال ڪيو وڃي.بهرحال، SuperScript II ۽ ThermoScript 50°C يا ان کان وڌيڪ تي رد عمل ظاهر ڪري سگھن ٿا، جيڪو گهٽ درجه حرارت تي پيدا ٿيندڙ غير مخصوص شين کي ختم ڪري ڇڏيندو.وڌ ۾ وڌ خاصيت لاءِ، آر اين اي/پرائمر مڪس کي 65°C denaturation temperature کان سڌو منتقل ڪري سگھجي ٿو ريورس ٽرانسڪرپشن انڪيوبيشن گرمي پد تي ۽ شامل ڪري سگھجي ٿو اڳئين گرم ٿيل 2× ريشن ميڪس (cDNA synthesis hot start).هي گهٽ درجه حرارت تي انٽرموليڪيولر بنيادي جوڙي کي روڪڻ ۾ مدد ڪري ٿو.RT-PCR لاءِ گهربل ڪيترن ئي درجه حرارت جي منتقلي کي تھرمل سائيڪل استعمال ڪندي آسان بڻائي سگھجي ٿو.

3. جينومڪ ڊي اين اي آلودگي کي گھٽائي ٿو:

RT-PCR سان پيش ايندڙ هڪ امڪاني مشڪل آر اين اي ۾ جينومڪ ڊي اين اي جي آلودگي آهي.سٺو آر اين اي آئسوليشن جو طريقو استعمال ڪرڻ، جهڙوڪ ٽريزول ريجنٽ، آر اين اي جي تياري کي آلوده ڪندڙ جينومڪ ڊي اين اي جي مقدار کي گھٽائي ڇڏيندو.جينومڪ ڊي اين اي مان نڪتل شين کان بچڻ لاءِ، آر اين اي کي ريورس ٽرانسڪرپشن کان اڳ آلوده ڊي اين اي کي ختم ڪرڻ لاءِ ايمپليفڪيشن گريڊ ڊي اين اي سان علاج ڪري سگهجي ٿو.DNase I هضمي کي ختم ڪيو ويو نمونن کي 2.0 mM EDTA ۾ 10 منٽن لاءِ 65 ° C تي.EDTA مگنيشيم آئن کي چيليٽ ڪري سگھي ٿو، مگنيشيم آئن-انحصار آر اين اي هائڊروليسس کي تيز گرمي پد تي روڪيو.

جينومڪ ڊي اين اي ايمپليفڪيشن پراڊڪٽس کي آلودگيءَ کان وڌائڻ لاءِ ايمپليفائيڊ سي ڊي اين اي کي الڳ ڪرڻ لاءِ، پرائمر ٺاهي سگھجن ٿا ته هر انيل کي الڳ الڳ exons ڪرڻ لاءِ.پي سي آر پروڊڪٽس جيڪي سي ڊي اين اي مان نڪتل آهن انهن کان ننڍا هوندا جيڪي آلوده جينومڪ ڊي اين اي مان نڪتل آهن.ان کان علاوه، هڪ ڪنٽرول تجربو بغير ريورس ٽرانسپشن جي هر آر اين اي ٽيمپليٽ تي ڪيو ويو ته اهو طئي ڪرڻ لاء ته ڇا ڏنل ٽڪرا جينوميڪ ڊي اين اي يا سي ڊي اين اي مان نڪتل آهي.ريورس ٽرانسپشن کان سواءِ حاصل ڪيل پي سي آر پراڊڪٽ جينوم مان نڪتل آهي.