اوسر
ٽرانسجنڪ ٻوٽن جي تيز سڃاڻپ
متن / ٽونگ يوچينگ
تجرباتي آپريشن/هان ينگ
ايڊيٽر/وين يوجن
لفظ/1600+
تجويز ڪيل پڙهڻ جو وقت/8-10 منٽ
ٽرانسجنڪ ٻوٽن جي تيز سڃاڻپ
ليبارٽري ۾ نئين اچڻ واري جي حيثيت سان، اهو سٺو ڪم نه آهي ته مثبت ٻوٽن جي ٻوٽن جي هڪ گروپ مان گهٽ تبديلي جي شرح سان اسڪريننگ ڪرڻ.سڀ کان پهرين، هڪ هڪ ڪري وڏي تعداد ۾ نمونن مان ڊي اين اي ڪڍڻو پوندو، ۽ پوءِ پي سي آر ذريعي غير ملڪي جين کي معلوم ڪيو ويندو.بهرحال، نتيجا اڪثر ڪري خالي هوندا آهن ۽ بينڊ ڪڏهن ڪڏهن ڪجهه شيون سان، پر اهو طئي ڪرڻ ناممڪن آهي ته ڇا گم ٿيل دريافتون آهن يا غلط دريافتون..ڇا اهڙي تجرباتي عمل ۽ نتيجن کي منهن ڏيڻ بلڪل بي وس آهي؟پريشان نه ٿيو، ڀاءُ توهان کي سيکاري ٿو ته ڪيئن آساني سان ۽ صحيح طور تي ٽرانسجنڪ مثبت ٻوٽن جي اسڪريننگ ڪجي.
قدم 1: ڊيزائن جي سڃاڻپ پرائمر
جانچ ڪرڻ لاءِ نمونن جي مطابق معلوم ٿيڻ لاءِ endogenous جين ۽ exogenous جين جو اندازو لڳايو، ۽ پرائمر ڊيزائن لاءِ جين ۾ نمائندو 100-500bp تسلسل چونڊيو.سٺا پرائمر ڳولڻ جي نتيجن جي درستگي کي يقيني بڻائي سگهن ٿا ۽ ڳولڻ جي وقت کي مختصر ڪري سگھن ٿا (عام طور تي استعمال ٿيل تشخيص پرائمر لاء ضميمه ڏسو).
نوٽ:
نئين ڊزائين ڪيل پرائمر کي رد عمل جي حالتن کي بهتر ڪرڻ جي ضرورت آهي ۽ وڏي پيماني تي چڪاس ڪرڻ کان اڳ ڳولڻ جي درستگي، درستي، ۽ ڳولڻ جي حد جي تصديق ڪرڻ جي ضرورت آهي.
قدم 2:تجرباتي پروٽوڪول کي ترقي ڪريو
مثبت ڪنٽرول: صاف ٿيل ڊي اين اي استعمال ڪريو جنھن ۾ ھدف جي ٽڪرا ھڪڙي ٽيمپليٽ جي طور تي طئي ڪيو وڃي ته ڇا پي سي آر ردعمل سسٽم ۽ حالتون عام آھن.
ناڪاري/خالي ڪنٽرول: استعمال ڪريو DNA ٽيمپليٽ يا ddH2اي جنهن ۾ ٽارگيٽ ٽڪرا شامل نه آهي ٽيمپليٽ جي طور تي اهو معلوم ڪرڻ لاءِ ته ڇا پي سي آر سسٽم ۾ آلودگي جو ڪو ذريعو آهي.
اندروني حوالو ڪنٽرول: استعمال ڪريو پرائمر/پروب جي ميلاپ جي آخرت جي جين نموني جي جانچ ڪرڻ لاءِ جانچڻ لاءِ ته ڇا ٽيمپليٽ پي سي آر ذريعي ڳولي سگهجي ٿو.
نوٽ:
مثبت، منفي/خالي ڪنٽرول ۽ اندروني ڪنٽرول ڪنٽرول هر ٽيسٽ لاءِ مقرر ڪيا وڃن ته جيئن تجرباتي نتيجن جي صحيحيت جو اندازو لڳايو وڃي.
قدم 3: تجربي جي تياري
استعمال ڪرڻ کان اڳ، ڏسو ته ڇا حل هڪجهڙائي سان ملايو ويو آهي.جيڪڏهن ورهاڱي ملي ٿي، ان کي استعمال ڪرڻ کان اڳ هدايتن جي مطابق تحلیل ۽ ملايو وڃي.2×PCR مکس کي پائپٽ ڪرڻ جي ضرورت آهي ۽ بار بار مائڪروپيپيٽ سان ملايو وڃي استعمال ڪرڻ کان اڳ غير برابر آئن ورڇ کان بچڻ لاءِ.
نوٽ:
ھدايتون ڪڍي وٺو ۽ انھن کي احتياط سان پڙھو، ۽ تجربي کان اڳ تياري ڪريو سختي سان ھدايتن جي مطابق.
قدم 4: تيار ڪريو PCR ردعمل سسٽم
تجرباتي پروٽوڪول جي مطابق، پرائمر کي ملايو، ايڇ2اي، 2 × پي سي آر ملائي، سينٽرفيوج ۽ انهن کي هر رد عمل واري ٽيوب تي ورهايو.
نوٽ:
وڏي پيماني تي يا ڊگهي مدت جي جاچ لاءِ، اها سفارش ڪئي وئي آهي ته PCR رد عمل وارو نظام استعمال ڪيو وڃي جنهن ۾ UNG اينزيم شامل آهي، جيڪو مؤثر طريقي سان پي سي آر جي شين جي ڪري ايروسول آلودگي کان بچي سگهي ٿو.
قدم 5: ردعمل ٽيمپليٽ شامل ڪريو
سڌو پي سي آر ٽيڪنالاجي استعمال ڪندي، سخت نيوڪليڪ ايسڊ صاف ڪرڻ واري عمل جي ڪا ضرورت ناهي.نموني ٽيمپليٽ 10 منٽن اندر تيار ڪري سگھجي ٿو ۽ لاڳاپيل PCR ردعمل سسٽم ۾ شامل ڪيو ويو.
نوٽ:
ليسس جو طريقو بهتر ڳولڻ وارو اثر آهي، ۽ حاصل ڪيل پيداوار ڪيترن ئي ڳولڻ جي رد عمل لاء استعمال ڪري سگهجي ٿو.
5.1: پنن جو سڌو PCR
دستي ۾ ڏنل تصوير جي ماپ مطابق، 2-3 ملي ميٽر جي قطر سان پتي جي ٽشو کي ڪٽيو ۽ ان کي PCR ردعمل سسٽم ۾ رکو.
نوٽ: پڪ ڪريو ته پنن جا ٽڪرا مڪمل طور تي پي سي آر جي رد عمل جي حل ۾ ڊهي ويا آهن، ۽ وڌيڪ پتي جي ٽشو شامل نه ڪريو.
5.2: ليف ليسس جو طريقو
پتي جي ٽشو کي 5-7 ملي ميٽر جي قطر سان ڪٽيو ۽ ان کي سينٽرفيوج ٽيوب ۾ رکو.جيڪڏھن توھان پختو پنن کي چونڊيو، مھرباني ڪري پنن جي مکيه رگ جي ٽشوز کي استعمال ڪرڻ کان پاسو ڪريو.Pipette 50ul Buffer P1 lysate کي سينٽريفيوج ٽيوب ۾ وجھو ته جيئن lysate پتي جي ٽشو کي مڪمل طور تي وجھي سگھي، ان کي ٿرمل سائيلر يا ميٽل باٿ ۾ رکي، ۽ 5-10 منٽن لاءِ 95°C تي لڪايو.
50ul بفر P2 غير جانبدار حل شامل ڪريو ۽ چڱي طرح گڏ ڪريو.نتيجو lysate هڪ ٽيمپليٽ طور استعمال ڪري سگهجي ٿو ۽ PCR رد عمل سسٽم ۾ شامل ڪيو ويو.
نوٽ: ٽيمپليٽ جو مقدار PCR سسٽم جي 5-10٪ جي وچ ۾ هجڻ گهرجي، ۽ 20٪ کان وڌيڪ نه هجڻ گهرجي (مثال طور، 20μl PCR سسٽم ۾، 1-2μl lysis بفر شامل ڪريو، 4μl کان وڌيڪ نه).
قدم 6: پي سي آر رد عمل
PCR رد عمل واري ٽيوب کي سينٽرفيوج ڪرڻ کان پوءِ، ان کي پي سي آر اوزار ۾ وڌو.
نوٽ:
رد عمل ايمپليفڪيشن لاءِ غير صاف ٿيل ٽيمپليٽ استعمال ڪري ٿو، تنهنڪري ايمپليفڪيشن سائيڪلن جو تعداد 5-10 وڌيڪ چڪر آهي جڏهن ته صاف ٿيل ڊي اين اي ٽيمپليٽ استعمال ڪرڻ جي ڀيٽ ۾.
قدم 7: Electrophoresis جو پتو لڳائڻ ۽ نتيجن جو تجزيو
M: 100bp DNA Ladder
1 \ 4: صاف ٿيل ڊي اين اي طريقو
2\5: سڌو PCR طريقو
3\6: خالي ڪنٽرول
معيار تي ضابطو:
تجربن ۾ مقرر ڪيل مختلف ڪنٽرولن جا امتحان جا نتيجا هيٺين شرطن کي پورا ڪرڻ گهرجن.ٻي صورت ۾، مسئلي جي سبب جو تجزيو ڪيو وڃي، ۽ مسئلو ختم ٿيڻ کان پوء ٻيهر ٽيسٽ ڪيو وڃي.
ٽيبل 1. مختلف ڪنٽرول گروپن جا عام امتحان جا نتيجا
*جڏهن پلازميڊ کي مثبت ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويندو آهي، انڊوجينس جين ٽيسٽ جو نتيجو منفي ٿي سگهي ٿو
نتيجو فيصلو:
A. نموني جي endogenous gene جو امتحان جو نتيجو ناڪاري آهي، جنهن مان ظاهر ٿئي ٿو ته DNA عام PCR جي چڪاس لاءِ موزون نموني مان ڪڍي نٿو سگهجي يا ڪڍيل DNA ۾ PCR ردعمل انابيٽرز شامل آهن، ۽ DNA کي ٻيهر ڪڍڻ گهرجي.
B. نموني جي endogenous جين جو امتحان جو نتيجو مثبت آهي، ۽ Exogenous جين جو امتحان جو نتيجو ناڪاري آهي، جنهن مان ظاهر ٿئي ٿو ته عام PCR جي چڪاس لاءِ مناسب ڊي اين اي نموني مان ڪڍيو ويو آهي، ۽ اهو اندازو لڳائي سگهجي ٿو ته نموني ۾ ايڪس اينڪس جين جي نشاندهي نه ڪئي وئي آهي.
C. نموني جي endogenous gene جو امتحان جو نتيجو مثبت آهي، ۽ exogenous gene جو امتحان جو نتيجو مثبت آهي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته DNA عام PCR جي چڪاس لاءِ موزون نموني مان ڪڍيو ويو آهي، ۽ نموني DNA ۾ XXX جين شامل آهي.تصديق جا تجربا اڳتي هلي سگهجن ٿا.
مرحلا 8: ڊيزائن جي سڃاڻپ پرائمر
تجربن کان پوء، ماحولياتي آلودگي کي روڪڻ لاء تجرباتي علائقي کي مسح ڪرڻ لاء 2٪ سوڊيم هائپو ڪلورائٽ حل ۽ 70٪ ايٿانول حل استعمال ڪريو.
ضميمو
جدول 2. جينياتي طور تي تبديل ٿيل ٻوٽن جي عام پي سي آر جي چڪاس لاءِ عام طور تي استعمال ٿيل پرائمر
حوالو سند:
SN/T 1202-2010، کاڌي ۾ جينياتي طور تي تبديل ٿيل ٻوٽن جي اجزاء لاءِ ڪيفيت واري PCR ڳولڻ جو طريقو.
زراعت جي وزارت جو اعلان 1485-5-2010، جينياتي طور تي تبديل ٿيل ٻوٽن ۽ انهن جي شين جي اجزاء جي جانچ - چانور M12 ۽ ان مان نڪتل شيون.
پوسٽ ٽائيم: جون-09-2021
