COVID-19 هڪ انتشار واري بيماري آهي جيڪا Severe Acute Respiratory Syndrome ڪرونا وائرس ٽائپ 2 جي ڪري ٿئي ٿي. جڏهن ڪو ماڻهو متاثر ٿئي ٿو، سڀ کان وڌيڪ عام علامتن ۾ بخار، کنگهه ۽ ساهه جي تڪليف شامل آهن.

جانچ لاءِ استعمال ٿيل نمونا nasopharyngeal swabs يا oropharyngeal swabs ذريعي گڏ ڪري سگھجن ٿا.

PCR ڇا آهي؟

ڪورونوايرس جي سڃاڻپ جو معياري طريقو پوليميرس زنجير ردعمل، پي سي آر آهي.هي هڪ طريقو آهي جيڪو وڏي پيماني تي ماليڪيولر حياتيات ۾ استعمال ٿيندو آهي.اهو جلدي لکين کان اربين مخصوص ڊي اين اي ٽڪرن کي نقل ڪري سگهي ٿو.

نئون ڪورونوايرس هڪ تمام ڊگهو سنگل اسٽرينڊ آر اين اي جينوم تي مشتمل آهي.پي سي آر ذريعي انهن وائرسن کي ڳولڻ لاءِ، آر اين اي ماليڪيولز کي لازمي طور تي انهن جي مڪمل ڊي اين اي جي ترتيبن ۾ ريورس ٽرانسڪرپٽ ذريعي تبديل ڪيو وڃي ٿو، ۽ پوءِ نئين ٺهيل ڊي اين اي کي معياري پي سي آر جي طريقي سان وڌايو وڃي ٿو، جنهن کي عام طور تي RT-PCR طور سڃاتو وڃي ٿو.

RT-PCR عمل

آر اين اي ڪڍڻ

هن طريقي کي انجام ڏيڻ لاء، وائرل آر اين اي کي بنيادي طور تي ڪڍڻ گهرجي.آر اين اي صاف ڪرڻ واري ڪٽس جو هڪ قسم آسان، تيز ۽ مؤثر علحدگيء لاء استعمال ڪري سگهجي ٿو.

ڪمرشل کٽ استعمال ڪندي وائرل RNA ڪڍڻ لاءِ، پھرين نموني کي مائڪرو سينٽريفيوج ٽيوب ۾ شامل ڪريو ۽ پوءِ ان کي ليسس بفر سان ملايو.هي بفر انتهائي denatured آهي ۽ عام طور تي فينول ۽ guanidine isothiocyanate تي مشتمل آهي.ان کان علاوه، RNase inhibitors عام طور تي موجود آهن lysis بفر ۾ برقرار وائرل RNA جي اڪيلائي کي يقيني بڻائڻ لاء.

ليسس بفر کي شامل ڪرڻ کان پوء، نبض ذريعي ملائي ٽيوب کي وورٽيڪس ڪريو ۽ ڪمري جي حرارت تي انڪيوبيٽ ڪريو.وائرس پوءِ ليسس بفر پاران مهيا ڪيل انتهائي خراب حالتن جي تحت لڪايو ويندو آهي.

نموني کي ليس ٿيڻ کان پوء، هڪ سينٽرفيوج ٽيوب کي صاف ڪرڻ جي طريقيڪار لاء استعمال ڪيو ويندو آهي.نموني کي سينٽرفيوج ٽيوب ۾ لوڊ ڪيو ويندو آهي ۽ پوءِ سينٽرفيوج ڪيو ويندو آهي.

اهو طريقو هڪ مضبوط مرحلو ڪڍڻ وارو طريقو آهي جنهن ۾ اسٽيشنري مرحلو سليڪا جيل ميٽرڪس تي مشتمل آهي.

مناسب لوڻ ۽ پي ايڇ جي حالتن ۾، آر اين اي ماليڪيول سليڪا جھلي سان جڙيل آهن.

ساڳئي وقت، پروٽين ۽ ٻين آلودگي ختم ٿي ويا آهن.

سينٽريفيوگيشن کان پوءِ، سينٽرفيوج ٽيوب کي صاف ڪليڪشن ٽيوب ۾ وجھو، فلٽريٽ کي رد ڪريو، ۽ پوءِ واشنگ بفر شامل ڪريو.

ٽيوب کي ٻيهر سينٽرفيوج ۾ رکو ته جيئن ڌوئڻ واري بفر کي جھلي ذريعي زور ڏنو وڃي.اهو جھلي مان باقي بچيل سموريون شيون ختم ڪري ڇڏيندو، صرف آر اين اي کي سليڪا جيل سان جڪڙي ڇڏيندو.

نموني کي ڌوئڻ کان پوء، ٽيوب کي صاف مائڪرو سينٽريفيوج ٽيوب ۾ وجھو ۽ ايليوشن بفر شامل ڪريو.

ان کان پوءِ ان کي سينٽرفيوز ڪيو ويندو آهي ته جيئن ايليوشن بفر کي جھلي ذريعي مجبور ڪري سگهجي.ايليوشن بفر وائرل RNA کي اسپين ڪالمن مان ڪڍي ٿو ۽ حاصل ڪري ٿو خالص آر اين اي حاصل ڪري ٿو جيڪو پروٽين، انابيٽرز ۽ ٻين آلودگي کان پاڪ آهي.

قدم 2

مخلوط توجهه

وائرل آر اين اي کي ڪڍڻ کان پوء، ايندڙ قدم پي سي آر ايمپليفڪيشن لاء ردعمل مرکب تيار ڪرڻ آهي.هن مرحلي ۾، concentrate استعمال ڪيو ويندو آهي.هي مرڪوز حل هڪ پريمڪس ٿيل مرڪوز حل آهي جنهن ۾ هڪ پريمڪس، ريورس ٽرانسڪرپٽ، نيوڪليوٽائڊس، فارورڊ پرائمر، ريورس پرائمر، TaqMan پروب ۽ ڊي اين اي پوليمريز شامل آهن.

آخرڪار، هن ردعمل جي مرکب کي مڪمل ڪرڻ لاء، آر اين اي ٽيمپليٽ شامل ڪيو ويو آهي.نلڪن کي پلس وورٽيڪسنگ ذريعي ملايو ويندو آهي، ۽ پوءِ رد عمل جو مرکب پي سي آر پليٽ ۾ ڀريو ويندو آهي.PCR پليٽ ۾ عام طور تي 96 کوهه شامل آهن ۽ هڪ ئي وقت ڪيترن ئي نمونن جو تجزيو ڪري سگهن ٿا.

قدم 3

پي سي آر وڌائڻ

اڳيون، پليٽ کي پي سي آر مشين ۾ رکو، جيڪو لازمي طور تي تھرمل سائيڪلر آھي.

ريئل ٽائيم RT-PCR استعمال ڪيو ويندو آهي 2019 ناول ڪوروناوائرس کي ڳولڻ لاءِ RdrRP جين، اي جين ۽ اين جين ۾ ٽارگيٽ جي ترتيب کي وڌائيندي.ٽارگيٽ جين جو انتخاب پرائمر ۽ تحقيق جي ترتيب تي منحصر آهي.

RT-PCR جو پهريون قدم ريورس ٽرانسپشن آهي.مڪمل ڪندڙ ڊي اين اي جو پهريون اسٽرينڊ ٺهيل آهي، جيڪو PCR ريورس پرائمر ذريعي شروع ڪيو ويو آهي، جيڪو وائرل RNA جينوم جي مڪمل حصي سان جڙيل آهي.پوءِ ريورس ٽرانسڪرپٽ ڊي اين اي نيوڪليوٽائڊس شامل ڪري ٿو پرائمر جي 3′آخر ۾ ڊي اين اي کي مڪمل ڪرڻ لاءِ وائرل آر اين اي سان ٺهڪندڙ.هن قدم جي درجه حرارت ۽ مدت جو دارومدار پرائمر، ٽارگيٽ آر اين اي، ۽ استعمال ٿيل ريورس ٽرانسڪرپٽ تي.

اڳيون، هڪ ابتدائي denaturation قدم لاڳو ڪيو ويو آهي، جنهن جي نتيجي ۾ RNA-DNA هائبرڊ جي تباهي جي نتيجي ۾.اهو قدم ڊي اين اي پوليميرس کي چالو ڪرڻ لاء ضروري آهي.ساڳئي وقت، ريورس ٽرانسڪرپٽ غير فعال آهي.

PCR حرارتي چڪر جي هڪ سيريز تي مشتمل آهي.هر چڪر تي مشتمل آهي denaturation، annealing ۽ توسيع قدم.

رد عمل واري مرحلي ۾ رد عمل واري چيمبر کي 95 درجا سينٽي گريڊ تائين گرم ڪرڻ ۽ ان کي ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي ٽيمپليٽ جي خراب ٿيڻ لاءِ استعمال ڪرڻ شامل آهي.

ايندڙ قدم ۾، رد عمل جو گرمي پد 58 درجا سينٽي گريڊ تائين گھٽجي وڃي ٿو، جيڪو اڳتي هلي پرائمر کي ان جي سنگل اسٽرينڊڊ ڊي اين اي ٽيمپليٽ جي مڪمل حصي سان ڳنڍڻ جي اجازت ڏئي ٿو.annealing جي درجه حرارت سڌو سنئون پرائمر جي ڊيگهه ۽ ساخت تي منحصر آهي.

توسيع واري مرحلي ۾، ڊي اين اي پوليمريز هڪ نئين ڊي اين اي اسٽرينڊ کي ٺهڪندڙ ڪري ٿو جيڪو ڊي اين اي ٽيمپليٽ اسٽرينڊ جي مڪمل آهي.رد عمل جي مرکب مان 5′کان 3′ڊائريڪشن ۾ ٽيمپليٽ ۾ مفت نيوڪليس مڪمل ڪرڻ سان.هن قدم جو گرمي پد استعمال ٿيل ڊي اين اي پوليمريز تي منحصر آهي.

پهرين چڪر کان پوء، هڪ ڊبل اسٽريٽ ڊي اين اي ٽارگيٽ حاصل ڪيو ويو آهي.

پوء، ٻيو چڪر داخل ڪريو.ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي کي رد ڪيو ويو آهي ته جيئن ٻه سنگل اسٽرينڊ ڊي اين اي ماليڪيول پيدا ٿين.

ايندڙ قدم ۾، رد عمل جي گرمي پد کي گهٽايو ويندو آهي، پرائمر هر هڪ ڀريل ڊي اين اي ٽيمپليٽ سان ڳنڍيل آهن، ۽ Taq-man پروب کي ٽارگيٽ ڊي اين اي جي مڪمل حصي سان ڳنڍيو ويندو آهي.

TaqMan پروب هڪ فلوروفور تي مشتمل آهي، جيڪو oligonucleotide پروب جي 5′ آخر سان ڳنڍيل آهي.جڏهن سائيلر جي روشنيءَ مان اتساهه ٿئي ٿو، ته فلوروفور فلورسنس خارج ڪري ٿو.ان کان علاوه، تحقيق 3′ آخر ۾ هڪ quencher سان ٺهيل آهي.quencher جي رپورٽر جين جي ويجهڙائي fluorescence جي ڳولا کي روڪي ٿو.

توسيع واري مرحلي ۾، ڊي اين اي پوليمريس هڪ نئين اسٽينڊ کي ٺهڪندڙ ڪري ٿو.جڏهن پوليمريز TaqMan پروب تائين پهچندي آهي، ته ان جي 5′nuclease سرگرمي پروب کي صاف ڪري ٿي، رنگ کي quencher کان جدا ڪري ٿي.

PCR جي هر چڪر سان، وڌيڪ رنگ جا ماليڪيولز جاري ڪيا ويندا آهن، جنهن جي نتيجي ۾ fluorescence جي شدت ۾ اضافو ٿيندو آهي، جنهن جي تناسب سان ٺهيل ايمپليڪن جي تعداد ۾.

اهو طريقو نموني ۾ موجود ڏنل ترتيب جي تعداد جو اندازو لڳائڻ جي اجازت ڏئي ٿو.هر چڪر ۾ ڊبل-اسٽرينڊ ڊي اين اي ٽڪڙن جو تعداد ٻيڻو ٿئي ٿو.تنهن ڪري، پي سي آر استعمال ڪري سگهجي ٿو تمام ننڍن نمونن جو تجزيو ڪرڻ لاء.

فلورسنٽ سگنل کي ماپڻ لاءِ، ٽنگسٽن هالوجن ليمپ، ايڪسائيٽيشن فلٽر، ريفلڪٽر، لينس، ايميشن فلٽر ۽ چارج ملائيندڙ ڊيوائس-استعمال CCD ڪئميرا.

قدم 4 معلوم ڪريو

فلورسنٽ سگنل کي ماپڻ لاءِ، ٽنگسٽن هالوجن ليمپ، ايڪسائيٽيشن فلٽر، ريفلڪٽر، لينس، ايميشن فلٽر ۽ چارج ملائيندڙ ڊيوائس-استعمال CCD ڪئميرا.

چراغ مان فلٽر ٿيل روشني ريفلڪٽر ذريعي ظاهر ٿئي ٿي، ڪنڊينسر لينس مان گذري ٿي، ۽ هر سوراخ جي مرڪز ڏانهن مرکوز آهي.پوءِ سوراخ مان خارج ٿيل فلورسنس آئيني مان ظاهر ٿئي ٿو، خارج ٿيڻ واري فلٽر مان گذري ٿو، ۽ سي سي ڊي ڪئميرا ذريعي معلوم ٿئي ٿو.هر پي سي آر جي چڪر ۾، سي سي ڊي پاران خود پرجوش فلوروفور لائيٽ ڳولي سگهجي ٿو.

اهو قبضو ڪيل روشني کي ڊجيٽل ڊيٽا ۾ تبديل ڪري ٿو.اهو طريقو حقيقي وقت پي سي آر سڏيو ويندو آهي، ۽ اهو پي سي آر جي رد عمل جي ترقي جي حقيقي وقت مانيٽرنگ جي اجازت ڏئي ٿو.