پي سي آر (پوليميرس زنجير ردعمل) هڪ ان-ويٽرو ڊي اين اي ايمپليفڪيشن ٽيڪنالاجيز مان هڪ آهي، جنهن جي تاريخ 30 سالن کان وڌيڪ آهي.

پي سي آر ٽيڪنالاجي 1983 ۾ سيٽس، يو ايس اي جي ڪيري موليس پاران شروع ڪئي وئي. موليس 1985 ۾ پي سي آر پيٽنٽ لاء درخواست ڪئي ۽ ساڳئي سال سائنس تي پهريون پي سي آر علمي مقالو شايع ڪيو.موليس کي سندس ڪم جي ڪري 1993ع ۾ ڪيمسٽري ۾ نوبل انعام ڏنو ويو.

PCR جا بنيادي اصول

PCR ٽارگيٽ ڊي اين اي جي ٽڪرن کي هڪ ملين کان وڌيڪ ڀيرا وڌائي سگھي ٿو.اصول ڊي اين اي پوليمريز جي ڪيٽيليسس جي تحت آهي، پيرن اسٽرينڊ ڊي اين اي کي ٽيمپليٽ جي طور تي استعمال ڪندي ۽ مخصوص پرائمر کي وڌائڻ جي شروعاتي نقطي طور.اهو ويٽرو ۾ نقل ڪيو ويو آهي قدمن ذريعي جيئن ته ٺهڪندڙ، اينيلنگ، ۽ واڌ.ڌيءَ اسٽرينڊ ڊي اين اي جو عمل پيرن اسٽرينڊ ٽيمپليٽ ڊي اين اي سان پورو ڪري ٿو.

معياري PCR عمل ٽن مرحلن ۾ ورهايل آهي:

1.Denaturation: DNA ڊبل اسٽرينڊ کي الڳ ڪرڻ لاءِ اعليٰ درجه حرارت استعمال ڪريو.ڊي اين اي ڊبل اسٽريڊس جي وچ ۾ هائڊروجن بانڊ تيز درجه حرارت (93-98 ℃) تي ڀڄي ويندو آهي.

2. Annealing: ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي جي الڳ ٿيڻ کان پوءِ، گرمي پد کي ھيٺ ڪريو ته جيئن پرائمر سنگل اسٽرينڊ ڊي اين اي سان جڙي سگھي.

3. ايڪسٽينشن: ڊي اين اي پوليمريز ڊي اين اي اسٽريڊس سان گڏ ڪمپليمينٽري اسٽريڊس کي گڏ ڪرڻ شروع ڪري ٿو پرائمر جي پابند کان جڏهن گرمي پد گهٽجي وڃي ٿي.جڏهن توسيع مڪمل ٿئي ٿي، هڪ چڪر مڪمل ٿي ويو آهي، ۽ ڊي اين اي ٽڪرن جو تعداد ٻيڻو ٿي ويندو آهي

انهن ٽنهي مرحلن کي 25-35 ڀيرا ورجائڻ سان، ڊي اين اي جي ٽڪرن جو تعداد تيزيءَ سان وڌي ويندو.

PCR جي آساني اها آهي ته مختلف پرائمر مختلف ٽارگيٽ جينز لاءِ ٺاهي سگهجن ٿا، ته جيئن ٽارگيٽ جين جا ٽڪرا ٿوري وقت ۾ وڌائي سگهجن.

هينئر تائين، پي سي آر کي ٽن ڀاڱن ۾ ورهائي سگهجي ٿو، يعني عام پي سي آر، فلورسنٽ مقداري پي سي آر ۽ ڊجيٽل پي سي آر.

عام PCR جو پهريون نسل

ٽارگيٽ جين کي وڌائڻ لاءِ هڪ عام پي سي آر ايمپليفڪيشن اوزار استعمال ڪريو، ۽ پوءِ پراڊڪٽ کي ڳولڻ لاءِ ايگرز جيل الیکٹروفورسس استعمال ڪريو، صرف معيار جو تجزيو ڪري سگهجي ٿو.

پهرين نسل جي PCR جا بنيادي نقصان:

1. غير مخصوص واڌارو ۽ غلط مثبت نتيجن جي ڪري.

2. ان جو پتو لڳائڻ هڪ ڊگهو وقت وٺندو آهي ۽ آپريشن مشڪل آهي.

3. صرف معيار جي جاچ ڪري سگهجي ٿي

ٻيو نسل حقيقي وقت پي سي آر

ريئل ٽائم پي سي آر، جيڪو پڻ qPCR جي نالي سان سڃاتو وڃي ٿو، فلورسنٽ پروبس استعمال ڪري ٿو جيڪي رد عمل واري نظام جي ترقي کي ظاهر ڪري سگھن ٿا، ۽ فلورسنٽ سگنلن جي جمع ذريعي وڌايل شين جي جمع کي مانيٽر ڪري ٿو، ۽ نتيجن کي فلوروسينس وکر ذريعي جج ڪري ٿو.اهو Cq قدر ۽ معياري وکر جي مدد سان مقدار کي طئي ڪري سگهجي ٿو.

ڇاڪاڻ ته qPCR ٽيڪنالاجي هڪ بند سسٽم ۾ ڪئي ويندي آهي، آلودگي جو امڪان گهٽجي ويندو آهي، ۽ فلورسنس سگنل کي مقدار جي چڪاس لاءِ مانيٽر ڪري سگهجي ٿو، تنهنڪري اهو سڀ کان وڏي پيماني تي ڪلينڪل عملي ۾ استعمال ٿيندو آهي ۽ PCR ۾ غالب ٽيڪنالاجي بڻجي چڪو آهي.

حقيقي وقت فلورسنٽ مقداري پي سي آر ۾ استعمال ٿيندڙ فلورسنٽ مواد کي ورهائي سگھجي ٿو: TaqMan فلورسنٽ پروب، ماليڪيولر بيڪنز ۽ فلورسنٽ رنگ.

1) TaqMan fluorescent تحقيق:

PCR امپليفڪيشن جي دوران، هڪ خاص فلورسنٽ پروب شامل ڪيو ويو آهي جڏهن ته پرائمر جو هڪ جوڙو شامل ڪيو ويو آهي.تحقيق هڪ oligonucleotide آهي، ۽ ٻنهي سرن تي هڪ رپورٽر فلورسنٽ گروپ ۽ هڪ quencher فلورسنٽ گروپ سان ليبل ٿيل آهن.

جڏهن پروب برقرار آهي، رپورٽر گروپ پاران خارج ٿيل فلورسنٽ سگنل quenching گروپ پاران جذب ڪيو ويندو آهي؛PCR ايمپليفڪيشن جي دوران، Taq اينزائم جي 5′-3′ Exonuclease سرگرمي جاچ کي ختم ڪري ٿي ۽ ان کي خراب ڪري ٿي، رپورٽر فلورسنٽ گروپ ۽ quencher فلورسنٽ گروپ کي الڳ ڪيو ويو آهي، ته جيئن فلورسنس مانيٽرنگ سسٽم فلورسنس سگنل وصول ڪري سگهي، يعني، هر دفعي هڪ ايم اين اي فلو ۽ ايم اين اي فلو آهي. فلورسنس سگنل جي جمع مڪمل طور تي PCR پيداوار جي ٺهڻ سان هم وقت سازي ڪئي وئي آهي.

2) SYBR فلورسنٽ رنگ:

PCR ردعمل سسٽم ۾، SYBR فلورسنٽ رنگ جي اضافي شامل ڪئي وئي آهي.SYBR فلورسنٽ ڊائي کان پوءِ غير خاص طور تي ڊي اين اي ڊبل اسٽرينڊ ۾ شامل ڪيو ويو آهي، اهو هڪ فلورسنٽ سگنل خارج ڪري ٿو.SYBR ڊائي ماليڪيول جنهن کي زنجير ۾ شامل نه ڪيو ويو آهي اهو ڪنهن به فلورسنٽ سگنل کي خارج نه ڪندو، ان ڪري فلورسنٽ سگنل کي يقيني بڻائيندو PCR پروڊڪٽس ۾ اضافو مڪمل طور تي PCR مصنوعات جي واڌ سان هم وقت سازي ڪئي وئي آهي.SYBR صرف ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي سان جڙيل آهي، تنهن ڪري پگھلڻ وارو وکر اهو طئي ڪرڻ لاءِ استعمال ڪري سگهجي ٿو ته ڇا PCR ردعمل مخصوص آهي.

3) ماليڪيولر بيڪن:

اهو هڪ اسٽيم-لوپ ڊبل-ليبل ٿيل oligonucleotide پروب آهي جيڪو 5 ۽ 3 سرن تي لڳ ڀڳ 8 بنيادن جي بال جي پنن جي جوڙجڪ ٺاهي ٿو.ٻنهي سرن تي نيوڪليڪ ايسڊ جي ترتيبن کي مڪمل طور تي جوڙيو ويو آهي، جنهن جي ڪري فلوروسنٽ گروپ ۽ quenching گروپ تنگ ٿي وڃي ٿو.بند ڪريو، ڪو به فلوروسنس پيدا نه ٿيندو.

PCR پراڊڪٽ جي پيدا ٿيڻ کان پوء، اينيلنگ جي عمل دوران، ماليڪيولر بيڪن جي وچ واري حصي کي هڪ مخصوص ڊي اين اي تسلسل سان جوڙيو ويندو آهي، ۽ فلوروسنٽ جين کي fluorescence پيدا ڪرڻ لاء quencher جين کان جدا ڪيو ويندو آهي.

ٻئين نسل جي PCR جا بنيادي نقصان:

حساسيت اڃا به گهٽ آهي، ۽ گهٽ ڪاپي جي نمونن جو پتو لڳائڻ غلط آهي.

اتي پس منظر جي قيمت جو اثر آهي، ۽ نتيجو مداخلت لاء حساس آهي.

جڏهن ردعمل سسٽم ۾ پي سي آر جي رڪاوٽون آهن، ڳولڻ جا نتيجا مداخلت لاء حساس هوندا آهن.

ٽيون نسل ڊجيٽل پي سي آر

ڊجيٽل پي سي آر (ڊجيٽل پي سي آر، ڊي پي سي آر، ڊيگ-پي سي آر) آخري پوائنٽ جي چڪاس ذريعي ٽارگيٽ جي ترتيب جي ڪاپي نمبر کي ڳڻائي ٿو، ۽ اندروني ڪنٽرول ۽ معياري وکر استعمال ڪرڻ کان سواء درست مطلق مقدار جي چڪاس انجام ڏئي سگھي ٿو.

ڊجيٽل پي سي آر آخري نقطي جي سڃاڻپ کي استعمال ڪري ٿو ۽ Ct قدر (سائيڪل جي حد) تي منحصر نه آهي، تنهنڪري ڊجيٽل پي سي آر رد عمل امپليفڪيشن ڪارڪردگي کان گهٽ متاثر ٿئي ٿو، ۽ پي سي آر جي رد عمل جي روڪٿام کي رواداري بهتر آهي، اعلي درستگي ۽ ٻيهر پيداوار سان.

اعلي حساسيت ۽ اعلي درستگي جي خاصيتن جي ڪري، اهو آساني سان PCR رد عمل جي مداخلت جي مداخلت نه آهي، ۽ اهو معياري مصنوعات جي بغير صحيح مطلق مقدار حاصل ڪري سگهي ٿو، جيڪو هڪ تحقيق ۽ ايپليڪيشن هٽ اسپاٽ بڻجي چڪو آهي.

ردعمل يونٽ جي مختلف شڪلن جي مطابق، ان کي ٽن مکيه قسمن ۾ ورهائي سگھجي ٿو: مائڪرو فلائيڊڪ، چپ ۽ بوند سسٽم.

1) Microfluidic ڊجيٽل PCR، mdPCR:

microfluidic ٽيڪنالاجي جي بنياد تي، ڊي اين اي ٽيمپليٽ کي الڳ ڪيو ويو آهي.microfluidic ٽيڪنالاجي نموني جي نانو اپ گريڊنگ يا ننڍڙن بوندن جي نسل کي محسوس ڪري سگهي ٿي، پر بوندن کي هڪ خاص جذب ڪرڻ واري طريقي جي ضرورت آهي ۽ پوء PCR ردعمل سسٽم سان گڏ.ايم ڊي پي سي آر کي تدريجي طور تي تبديل ڪيو ويو آهي ٻين طريقن سان.

2) قطرن تي ٻڌل ڊجيٽل پي سي آر، ڊي پي سي آر:

نموني کي بوندن ۾ پروسيس ڪرڻ لاءِ واٽر-ان-آئل بوندليٽ جنريشن ٽيڪنالاجي استعمال ڪريو، ۽ رد عمل واري نظام کي ورهايو جنهن ۾ نيوڪليڪ ايسڊ ماليڪيولز شامل آهن هزارين نانوسڪيل بوندن ۾، جن مان هر هڪ ۾ شامل نه آهي نيوڪليڪ ايسڊ ٽارگيٽ ماليڪيول معلوم ڪرڻ لاءِ، يا هڪ کان ڪيترن نيوڪلڪ ايسڊ ٽارگيٽ ماليڪيول تي مشتمل آهي جانچڻ لاءِ.

3) چپ تي ٻڌل ڊجيٽل پي سي آر، سي ڊي پي سي آر:

سلڪون ويفرز يا ڪوارٽز گلاس تي ڪيترن ئي مائڪروٽيوبس ۽ مائيڪرو ڪييوٽيز کي ڪٽڻ لاءِ انٽيگريٽيڊ فلوئڊ پاٿ وي ٽيڪنالاجي استعمال ڪريو، ۽ حل جي وهڪري کي مختلف ڪنٽرول والوز ذريعي ڪنٽرول ڪريو، ۽ نموني مائع کي ساڳي سائيز جي نانوميٽرن ۾ ورهايو ريڪشن ويلز ۾ ڊجيٽل پي سي آر ري ايڪشن لاءِ مڪمل مقدار کي حاصل ڪرڻ لاءِ.

ٽئين نسل جي PCR جي مکيه نقصان:

سامان ۽ ريجنٽ قيمتي آهن.

ٽيمپليٽ معيار جي گهرج اعلي آهن.جيڪڏهن ٽيمپليٽ جو مقدار مائڪرو سسٽم جي مقدار کان وڌيڪ آهي، اهو ناممڪن ٿي ويندو ته مقدار جو اندازو لڳائڻ، ۽ جيڪڏهن اهو تمام ننڍڙو آهي، ته مقدار جي درستگي گهٽجي ويندي.

غلط مثبت پڻ پيدا ڪري سگھجن ٿيون جڏهن اتي غير مخصوص واڌارو آهي.