RT-qPCR ماليڪيولر حياتيات جو بنيادي تجربو آهي، ۽ هر ڪنهن کي ان کان واقف هجڻ گهرجي.ان ۾ بنيادي طور تي ٽي مرحلا شامل آهن: آر اين اي ڪڍڻ، سي ڊي اين اي ۾ ريورس ٽرانسڪرپشن، ۽ حقيقي وقت فلورسنٽ مقداري پي سي آر.اهو مدد نٿو ڪري، ڇا ٿي رهيو آهي؟اهو امڪان آهي ته اتي هڪ مسئلو آهيريورس ٽرانسپشن جو تجربو!جيتوڻيڪ اهو لڳي ٿو ته ريورس ٽرانسپشن تجربو صرف آر اين اي، ڊي اين ٽي پي، پرائمر، ۽ شامل ڪرڻ جي ضرورت آهيريورس ٽرانسڪرپٽسينٽرفيوج ٽيوب ڏانهن ۽ چڱي طرح سان ملائي، پر حقيقي آپريشن جي عمل ۾، اڃا تائين ڪيترائي تفصيل آهن جن تي ڌيان ڏيڻ جي ضرورت آهي.اچو ته ان بابت ڄاڻون!

آر اين اي جي معيار جو فيصلو ڪيئن ڪجي؟
سي ڊي اين اي حاصل ڪرڻ لاءِ، آر اين اي جو معيار اهم آهي!آر اين اي جي معيار کي خاص طور تي ٻن حصن مان ڳولي سگهجي ٿو:
(1) آر اين اي سالميت:آر اين اي سالميت جي تصديق ڪري سگهجي ٿي agarose gel electrophoresis. eukaryotes کي مثال طور وٺندي، مڪمل ڪل RNA ۾ ٽي واضح بينڊ آهن، ماليڪيولر وزن وڏي کان ننڍي تائين 28S، 18S ۽ 5S آهن، ۽ 28S 18S کان ٻه ڀيرا روشن آهي؛جيڪڏهن ٽي بينڊ ڏسي سگهجن ٿا، پر بينڊ جو قسم blurred آهي يا Diffusion جو مطلب آهي ته RNA جزوي طور خراب ٿي چڪو آهي.هن وقت، مهرباني ڪري ريورس ٽرانسپشن رد عمل کي فوري طور تي انجام ڏيو ۽ ٽيمپليٽ ان پٽ کي مناسب طور تي وڌايو؛جيڪڏهن صرف هڪ بينڊ هڪ ننڍڙو ماليڪيولر وزن سان يا ڪو به بينڊ نظر نٿو اچي، آر اين اي مڪمل طور تي خراب ٿي چڪو آهي ۽ ٻيهر ڪڍڻ جي ضرورت آهي.Agilent 2100 آر اين اي جي سالميت کي چوٽي ڊاگرام ۽ RIN قدر سان اشارو ڪري ٿو.جيڪڏهن نيوڪليڪ ايسڊ برقرار آهي، اليڪٽرروفيروگرام جي بيس لائين فليٽ آهي؛جيڪڏهن نيوڪليڪ ايسڊ سخت خراب ٿي وڃي ٿي، بيس لائين اڻ برابر آهي ۽ وڌيڪ تباهي جون چوٽيون ظاهر ٿين ٿيون؛RIN جي قيمت آر اين اي جي سالميت کي ظاهر ڪري ٿي، 0-10 جي حد اندر، قيمت جيتري وڏي هوندي، آر اين اي جي معيار بهتر هوندي.خير، اعليٰ درجي جي مڪمل.
(2) آر اين اي جي پاڪائي:OD260/280 جو تناسب UV spectrophotometry ذريعي ڳولي سگھجي ٿو.جيڪڏهن OD260/280 جو تناسب 1.9 ۽ 2.1 جي وچ ۾ آهي، پاڪائي تمام سٺي آهي.
بقايا جينومڪ ڊي اين اي غلط مقدار جي نتيجن جي ڪري سگھي ٿو
جڏهن آر اين اي ڪڍيو ويندو آهي، اسان کي مليل آر اين اي جينومڪ ڊي اين اي (جي ڊي اين اي) سان ملي سگهي ٿي جيڪا صاف نه ڪئي وئي آهي.تنهن ڪري، ريورس ٽرانسپشن کان پوء سي ڊي اين اي کي به ملايو ويندوجي ڊي اين اي.هيٺاهين دورانqPCRرد عمل،سي ڊي اين اي۽ gDNA هڪ ئي وقت وڌائي سگهجي ٿو، نتيجي ۾ هڪ نسبتا ننڍڙو CT قدر، تنهن ڪري نتيجا باصلاحيت ٿي سگهن ٿا.
پوء اسان کي هن صورتحال ۾ ڇا ڪرڻ گهرجي؟اڳوڻوتجويز ڪري ٿو:
(1) ريورس ٿيل آر اين اي تي جينوم جي صفائي کي انجام ڏيو، جيڪو آر اين اي ڪڍڻ دوران ڪالمن کي ڪڍڻ سان ختم ڪري سگهجي ٿو.
(2) ڪڍيل آر اين اي جو علاج DNase سان ڪيو وڃيI ، پر ان کي EDTA سان ختم ڪريو؛
ريورس ٽرانسپشن ريجنٽس جوجينوم صاف ڪرڻ واري ماڊلز سان؛

ريورس ٽرانسپشن لاء پرائمر ڪيئن چونڊيو؟
ريورس ٽرانسپشن پرائمر پڻ ريورس ٽرانسپشن جي رد عمل جي نتيجن کي متاثر ڪري ٿو.توهان تجربي جي مخصوص حالتن جي مطابق ريورس ٽرانسپشن لاءِ بي ترتيب پرائمر، Oligo dT يا جين مخصوص پرائمر چونڊي سگهو ٿا:
(1) مخصوص نقل: جين-مخصوص پرائمر سفارش ڪئي وئي آهي؛
(2) ڊگها ٽڪرا ٽڪرا: Oligo dT/ جين-مخصوص پرائمر سفارش ڪئي وئي آهي؛
(3) ڊگھي ڀاڱي جي ٽرانسڪرپٽس جا اندروني ٽڪرا: جين مخصوص پرائمر/ بي ترتيب پرائمر/ بي ترتيب پرائمر + اوليگو ڊي ٽي.جيڪڏهن بعد ۾ qPCR تجربو ڪيو ويو آهي، Oligo dT اڪيلو استعمال نه ٿو ڪري سگهجي، ڇاڪاڻ ته Oligo dT اڪيلو استعمال ڪرڻ سان 3′ آخر تعصب ٿي سگهي ٿو، غلط qPCR تجربن جي نتيجن جي ڪري؛
(4) miRNA: اسٽيم لوپ پرائمر يا ٽيلنگ پرائمر استعمال ڪري سگھجن ٿا.

ڪيترا ڀيرا ريورس ٽرانسڪرپشن پراڊڪٽ سي ڊي اين اي کي مقدار جي حساب سان گھٽايو وڃي؟
ريورس ٽرانسڪرپشن پراڊڪٽ جي سي ڊي اين اي حاصل ڪرڻ کان پوءِ، qPCR تجربن لاءِ سي ڊي اين اي کي ڪيترو وقت گھٽائڻ تمام ضروري آهي.جيڪڏهن سي ڊي اين جي ڪنسنٽريشن تمام گهڻي يا تمام گهٽ آهي، امپليفڪيشن جي ڪارڪردگي متاثر ٿي سگهي ٿي.ڇا سي ڊي اين اي ڪنسنٽريشن کي ماپي سگهجي ٿو، ۽ اهو ڪيئن ٿيڻ گهرجي؟
(1) ريورس ٽرانسڪرپشن پراڊڪٽ جي سي ڊي اين اي ڪنسنٽريشن کي ماپي نٿو سگهجي، ڇاڪاڻ ته سي ڊي اين اي پراڊڪٽ کان علاوه، ريورس ٽرانسڪرپشن پراڊڪٽ ۾ ريورس ٽرانسڪرپشن ريزيڊول بفر، ريورس ٽرانسڪرپشن، پرائمر وغيره شامل آهن، جيڪي ڪنسنٽريشن جي ماپ جي نتيجن ۾ مداخلت ڪندا ۽ ان ڪري OD260/280، OD260/280، abDNA/280، ODN236 صحيح نه ڪندا ميدان.هن وقت ڪي دوست چوندا ته پوءِ توجهه ماپيندس پاڪائي کان پوءِ؛هتي، Foregene اهو ياد ڏيارڻ چاهيندو ته سي ڊي اين اي کي صاف ڪرڻ جي سفارش نه ڪئي وئي آهي، ڇاڪاڻ ته ريورسل ذريعي حاصل ڪيل سي ڊي اين اي جي ڊيگهه مختلف آهي، ۽ مختصر cDNA صاف ڪرڻ ۾ گم ٿي ويندو.
(2) پوءِ ڇا ڪجي؟qPCR جي تجربي کان اڳ، سي ڊي اين اي جي گھٽتائي واري درجي کي اڳئين تجربن ذريعي طئي ڪري سگهجي ٿو.مثال طور: qPCR تجربن لاءِ ٽيمپليٽ جي طور تي cDNA اسٽاڪ حل، 10-گنا dilution، ۽ 100-fold dilution استعمال ڪريو، ۽ 18-28 جي رينج ۾ CT ويليو سان dilution فيڪٽر چونڊيو.

ڪيئن miRNAs کي ريورس ٽرانسڪرائب ڪيو وڃي؟
miRNA ھڪڙو ننڍڙو انوول RNA آھي جيڪو اٽڪل 22 nt جي سائيز سان آھي جيڪو پروٽين لاء ڪوڊ نٿو ڪري.ان جي مختصر ڊگھائي جي ڪري، روايتي qPCR طريقي سان ان کي سڌو سنئون اندازو ڪرڻ ڏکيو آهي، تنهنڪري اهو اڪثر ضروري آهي ته miRNA کي وڌايو وڃي؛miRNA لاءِ عام طور تي استعمال ٿيندڙ ريورس ٽرانسپشن جا طريقا شامل آهن اسٽيم لوپ جو طريقو ۽ ٽيلنگ جو طريقو.
اسٽيم-لوپ جو طريقو اسٽيم-لوپ پرائمر شامل ڪندي miRNA کي وڌائڻ آهي.اهو ڳولڻ جو طريقو اعلي حساسيت ۽ خاصيت آهي، پر ڳولڻ جي ذريعي گهٽ آهي.هڪ ريورس ٽرانسپشن صرف هڪ miRNA ۽ هڪ اندروني حوالو ڳولي سگهي ٿو.tail-adding طريقه ٻن حصن تي مشتمل آهي، اهو ٻن اينزائمز جي گڏيل عمل سان مڪمل ٿئي ٿو، جيڪي پولي اي پوليمريز ۽ ريورس ٽرانسڪرپٽيز آهن.پولي اي پوليميرس ان جي ڊگھائي وڌائڻ لاءِ miRNA ۾ PolyA tails شامل ڪرڻ جو ذميوار آهي، ۽ ريورس ٽرانسڪرپٽ ريورس ٽرانسڪرپشن رد عمل انجام ڏئي ٿو.ھن طريقي ۾ اعليٰ چڪاس ذريعي آھي ۽ ڪيترن ئي miRNAs ۽ اندروني حوالن کي ھڪڙي ريورس ٽرانسپشن ۾ ڳولي سگھي ٿو، پر اسٽيم لوپ طريقي ۾ حساسيت ۽ خاصيت گھٽ آھي.