PCR سڀ کان وڏي پيماني تي استعمال ٿيل نيوڪليڪ ايسڊ امپليفڪيشن ٽيڪنالاجي آهي ۽ ان جي حساسيت ۽ خاصيت جي ڪري وڏي پيماني تي استعمال ٿئي ٿي.جڏهن ته، پي سي آر کي بار بار حرارتي رد ڪرڻ جي ضرورت آهي ۽ آلات ۽ سامان تي ڀروسو ڪرڻ جي حدن کان نجات حاصل نه ڪري سگهي ٿي، جيڪا ڪلينڪ فيلڊ ٽيسٽ ۾ ان جي درخواست کي محدود ڪري ٿي.

1990 جي شروعات کان وٺي، ڪيتريون ئي ليبارٽريون مسلسل گرمي پد وڌائڻ واري ٽيڪنالاجي کي ترقي ڪرڻ شروع ڪري ڇڏيون آهن جن کي حرارتي رد ڪرڻ جي ضرورت ناهي.ھاڻي ھنن ترقي ڪئي آھي لوپ-ميڊيٽيڊ isothermal amplification ٽيڪنالاجي، Strand replacement isothermal amplification technology، rolling circul isothermal amplification technology، ۽ nucleic acid sequence dependence.Isothermal amplification ٽيڪنالاجي ۽ ٻيون ٽيڪنالاجيون. 

Loop-mediated isothermal amplification

ايمپليفڪيشن اصول ان حقيقت تي ٻڌل آهي ته ڊي اين اي 65 ڊگري سينٽي گريڊ تي متحرڪ توازن واري حالت ۾ آهي.جڏهن ڪنهن به پرائمر کي بنيادي طور تي جوڙيو ويندو آهي ۽ ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي جي مڪمل حصي تائين وڌايو ويندو آهي، ته ٻيو اسٽرينڊ الڳ ٿي ويندو ۽ اڪيلو ٿي ويندو.

هن گرمي پد تي، ڊي اين اي 4 مخصوص پرائمر استعمال ڪري ٿو هڪ اسٽرينڊ-ڊسپليسمينٽ ڊي اين اي پوليميرس تي ڀروسو ڪرڻ لاءِ ته جيئن اسٽينڊ-ڊسپليسمينٽ ڊي اين اي خود سرڪيوليشن جي سنٿيسس کي مسلسل جاري رکي.

پهريان 6 مخصوص علائقن جو تعين ڪريو F3, F2, F1, B1, B2, B3 ٽارگيٽ جين تي, ۽ پوءِ انھن 6 مخصوص علائقن جي بنياد تي 4 پرائمر ٺاھيو (جيئن ھيٺ ڏنل شڪل ۾ ڏيکاريل آھي):

اڳيون اندروني پرائمر (FIP) F1c ۽ F2 مان ٺهيل آهي.

پسمانده اندروني پرائمر (BIP) B1c ۽ B2 مان ٺهيل آهي، ۽ TTTT وچ ۾ اسپيسر طور استعمال ڪيو ويندو آهي.

ٻاهرين پرائمر F3 ۽ B3 ترتيب ڏنل آهن F3 ۽ B3 علائقن تي ٽارگيٽ جين تي.

LAMP ردعمل سسٽم ۾، اندروني پرائمر جي ڪنسنٽريشن ٻاهرين پرائمر جي ڀيٽ ۾ ڪيترائي ڀيرا آهي.اندروني پرائمر پهريون ڀيرو ٽيمپليٽ اسٽرينڊ سان گڏ ڪيو ويو آهي هڪ مڪمل اسٽرينڊ کي گڏ ڪرڻ لاءِ ڊي اين اي ڊبل اسٽرينڊ ٺاهڻ لاءِ.تنهن کان پوءِ، ٻاهرئين پرائمر کي ٽيمپليٽ اسٽرينڊ سان ملائي هڪ DNA ڊبل اسٽرينڊ ٺاهيو وڃي ٿو.BstDNA پوليمريز جي عمل جي تحت، اندروني پرائمر پاران ٺهيل مڪمل اسٽرينڊ جاري ڪيو ويو آهي.رد عمل جي هڪ سلسلي کان پوء، مڪمل ڪندڙ اسٽريڊ آخرڪار هڪ واحد ڊي اين اي اسٽريڊ ٺاهيندو آهي جنهن سان ڊمبل ساخت آهي.

ڊمبل ڍانچي ڊي اين اي سنگل اسٽرينڊ پاڻ هڪ ٽيمپليٽ طور استعمال ڪيو ويندو آهي مسلسل هڪ عارضي اسٽيم لوپ ڍانچي ڊي اين اي کي کليل آخر سان.اندرون ۽ ٻاهريون پرائمر عبوري اسٽيم-لوپ ڍانچي ڊي اين اي جي رهنمائي ڪن ٿا ته جيئن مسلسل اسٽينڊ ڊسپلسمينٽ ۽ ايڪسٽينشن رد عملن مان گذرن، ۽ آخر ۾ مختلف ڊگھائي سان ڪيترن ئي اسٽيم-لوپ ڍانچي ٺاهي.ڊي اين اي جو مرکب.

لوپ-ثالث isothermal amplification جا فائدا ۽ نقصان

LAMP جا فائدا:

(1) هاء ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي، جيڪا 1 ڪلاڪ اندر ٽارگيٽ جين جي 1-10 نقلن کي مؤثر طريقي سان وڌائي سگھي ٿي، ۽ ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي عام پي سي آر جي ڀيٽ ۾ 10-100 ڀيرا آهي.

(2) رد عمل جو وقت ننڍو آهي، خاصيت مضبوط آهي، ۽ ڪو خاص سامان گهربل ناهي.

LAMP جا نقص:

(1) پرائمر جي گهرج خاص طور تي اعلي آهي.

(2) وڌايل پيداوار ڪلوننگ ۽ ترتيب ڏيڻ لاءِ استعمال نه ٿي ڪري سگھجي، پر صرف فيصلي لاءِ استعمال ٿي سگھي ٿي.

(3) ان جي مضبوط حساسيت جي ڪري، ايروسول ٺاهڻ آسان آهي، غلط مثبت سبب ۽ امتحان جي نتيجن کي متاثر ڪري ٿو.

Sٽرانڊ ڊسپلسمينٽ ايمپليڪشن

Strand Displacement amplification (SDA) هڪ ان ويٽرو آئسوٿرمل ڊي اين اي ايمپليفڪيشن ٽيڪنڪ آهي جنهن جي بنياد تي اينزيميٽڪ ردعمل پهريون ڀيرو 1992 ۾ آمريڪي اسڪالر واڪر پاران تجويز ڪيل آهي.

SDA جي بنيادي سسٽم ۾ پابنديون endonuclease شامل آهن، هڪ DNA پوليمريز سان گڏ اسٽينڊ ڊسپليسمينٽ سرگرمي، پرائمر جا ٻه جوڙا، ڊي اين ٽي پيز، ۽ ڪلسيم ۽ ميگنيشيم آئنز ۽ بفر سسٽم.

اسٽرينڊ ڊسپليسمينٽ امپليفڪيشن جو اصول ڪيميائي طور تي تبديل ٿيل پابندين تي ٻڌل آهي endonuclease recognition sequence تي ٽارگيٽ ڊي اين اي جي ٻنهي سرن تي.Endonuclease ان جي سڃاڻپ واري سائيٽ تي اسٽينڊ ڊي اين اي ۾ خال کي کوليندو آهي، ۽ ڊي اين اي پوليميرس خال 3′ ختم ڪري ٿو ۽ ايندڙ ڊي اين اي اسٽرينڊ کي تبديل ڪري ٿو.

ڊي اين اي جي بدليل سنگل اسٽريڊس کي پرائمر سان ملائي سگھجي ٿو ۽ ڊي اين اي پوليمريز ذريعي ڊبل اسٽريڊس ۾ وڌايو وڃي.اهو عمل مسلسل بار بار ڪيو ويندو آهي، انهي ڪري ته ٽارگيٽ جي ترتيب کي موثر انداز ۾ وڌايو وڃي.

اسٽرينڊ بي گھرڻ واري ايمپليفڪيشن ٽيڪنالاجي جا فائدا ۽ نقصان

SDA جا فائدا:

amplification ڪارڪردگي اعلي آهي، رد عمل جو وقت ننڍو آهي، خاصيت مضبوط آهي، ۽ ڪنهن خاص سامان جي ضرورت ناهي.

SDA جون خاميون:

پراڊڪٽس يونيفارم نه هونديون آهن، ۽ ڪجهه سنگل اسٽرينڊ ۽ ڊبل اسٽرينڊ پروڊڪٽس هميشه SDA چڪر ۾ پيدا ٿينديون آهن، ۽ ٽيلنگ لازمي طور تي ٿينديون آهن جڏهن اليڪٽرروفورسس جي نشاندهي ڪئي ويندي آهي.

Rolling دائرو amplification

رولنگ سرڪل ايمپليفڪيشن (RCA) تجويز ڪيل طريقي تي ڊرائنگ ڪندي پيش ڪيو ويو آهي ڊي اين اي کي نقل ڪرڻ واري طريقي سان پيٿوجينڪ آرگنيزم مان رولنگ سرڪل ذريعي.اهو اشارو ڪري ٿو سنگل اسٽرينڊ سرڪلر ڊي اين اي جي استعمال کي ٽيمپليٽ جي طور تي هڪ مستقل درجه حرارت تي، ۽ هڪ خاص ڊي اين اي پوليمريس (جهڙوڪ Phi29) ) رولنگ سرڪل ڊي اين اي جي جوڙجڪ جي عمل جي تحت ٽارگيٽ جين جي واڌ کي حاصل ڪرڻ لاء.

آر سي اي کي ورهائي سگهجي ٿو لڪير جي امپلائيشن ۽ ايڪسپونيشنل ايمپليفڪيشن ۾.لڪير آر سي اي جي ڪارڪردگي 10 تائين پهچي سگھي ٿي⁵ڀيرا، ۽ تيزيءَ واري RCA جي ڪارڪردگي 10 تائين پهچي سگھي ٿي⁹ڀيرا.

سادي تفاوت، جيئن هيٺ ڏنل شڪل ۾ ڏيکاريل آهي، لينيئر ايمپليفڪيشن a صرف 1 پرائمر استعمال ڪري ٿو، Exponential amplification b ۾ 2 پرائمر آهن.

لڪير RCA پڻ سڏيو ويندو آهي سنگل پرائمر RCA.هڪ پرائمر سرڪلر ڊي اين اي سان جڙيل آهي ۽ ڊي اين اي پوليمريز جي عمل سان وڌايو ويو آهي.پراڊڪٽ هڪ لڪير وارو اڪيلو اسٽرينڊ آهي جنهن ۾ هڪ لوپ جي ڊگھائي هزارين ڀيرا ورجائيندڙ ترتيبن جي وڏي تعداد سان.

جيئن ته لڪير آر سي اي جي پيداوار هميشه شروعاتي پرائمر سان ڳنڍيل آهي، سگنل جو آسان طئي ڪرڻ هڪ وڏو فائدو آهي.

Exponential RCA، جنهن کي Hyper branched amplification HRCA (هائپر برانچڊ آر سي اي) جي نالي سان به سڃاتو وڃي ٿو، ايڪسپونيشنل RCA ۾، هڪ پرائمر RCA پراڊڪٽ کي وڌائي ٿو، ٻيو پرائمر RCA پراڊڪٽ سان هائبرڊائيز ڪري ٿو ۽ وڌائي ٿو، ۽ متبادل اڳ ۾ ئي RCA پراڊڪٽ جي پابند آهي، هيٺيون پرائمر اسٽينڊ کي وڌايو، ۽ ريپليٽ ايڪسٽينشن امپليفڪيشن آر سي اي پراڊڪٽ کي ورجائي ٿو.

رولنگ سرڪل نيوڪليڪ ايسڊ امپليڪشن جا فائدا ۽ نقصان

RCA جا فائدا:

هاء sensitivity، سٺي specificity ۽ آسان آپريشن.

RCA جي نقص:

سگنل ڳولڻ دوران پس منظر جا مسئلا.آر سي اي جي رد عمل دوران، غير گردش ٿيل پيڊلڪ پروب ۽ ان بائونڊ پروب جي ٽيمپليٽ ڊي اين اي يا آر اين اي شايد ڪجهه پس منظر سگنل پيدا ڪري سگھن ٿا. 

Nucleicacid تسلسل جي بنياد تي amplification

نيوڪليڪ ايسڊ سيڪوئنس بيسڊ امپليڪشن (NASBA) هڪ نئين ٽيڪنالاجي آهي جيڪا پي سي آر جي بنياد تي ٺاهي وئي آهي.اهو هڪ لڳاتار ۽ isothermal nucleic acid amplification آهي جنهن جي هدايت ڪئي وئي آهي پرائمر جي هڪ جوڙي سان T7 پروموٽر تسلسل سان.ٽيڪنالوجي آر اين اي ٽيمپليٽ کي تقريباً 2 ڪلاڪن ۾ 109 ڀيرا وڌائي سگھي ٿي، جيڪا روايتي پي سي آر طريقي کان 1000 ڀيرا وڌيڪ آهي ۽ ان کي خاص سامان جي ضرورت ناهي.

اها ٽيڪنالاجي ظاهر ٿيڻ سان ئي بيمارين جي تيزيءَ سان تشخيص لاءِ استعمال ڪئي وئي آهي ۽ هن وقت ڪيتريون ئي ڪمپنيون هن طريقي کي آر اين اي ڊيٽيڪشن ڪٽس ۾ استعمال ڪنديون آهن.

جيتوڻيڪ آر اين اي ايمپليفڪيشن ريورس ٽرانسڪرپشن پي سي آر ٽيڪنالاجي پڻ استعمال ڪري سگهي ٿي، NASBA جا پنهنجا فائدا آهن: اهو نسبتا مسلسل درجه حرارت جي حالتن ۾ ڪري سگهجي ٿو، ۽ اهو روايتي پي سي آر ٽيڪنالاجي کان وڌيڪ مستحڪم ۽ صحيح آهي.

رد عمل 41 درجا سينٽي گريڊ تي آهي ۽ مڪمل ڪرڻ لاءِ AMV (avian myeloblastosis virus) ريورس ٽرانسڪرپٽ، RNase H، T7 RNA پوليميرس ۽ هڪ جوڙو پرائمر جي ضرورت آهي.

عمل ۾ بنيادي طور تي شامل آهن:

فارورڊ پرائمر ۾ T7 پروموٽر جي مڪمل تسلسل شامل آهي.رد عمل دوران، فارورڊ پرائمر آر اين اي اسٽرينڊ سان ڳنڍجي ٿو ۽ AMV اينزيم پاران ڊي اين اي-آر اين اي ڊبل اسٽرينڊ ٺاهڻ لاءِ اتساهه ڪيو وڃي ٿو.

RNase H آر اين اي کي هائيبرڊ ڊبل اسٽرينڊ ۾ هضم ڪري ٿو ۽ سنگل اسٽرينڊ ڊي اين اي کي برقرار رکي ٿو.

ريورس پرائمر ۽ AMV اينزيم جي عمل جي تحت، هڪ ڊي اين اي ڊبل اسٽرينڊ ٺهيل آهي جنهن ۾ T7 پروموٽر تسلسل شامل آهي.

T7 آر اين اي پوليمريز جي عمل جي تحت، ٽرانسپشن جو عمل مڪمل ڪيو ويو آهي ۽ ٽارگيٽ آر اين اي جي وڏي مقدار پيدا ڪئي وئي آهي.

NASBA جا فائدا:

(1) ان جي پرائمر ۾ T7 پروموٽر تسلسل آهي، پر غير ملڪي ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي ۾ T7 پروموٽر تسلسل نه آهي ۽ ان کي وڌائي نٿو سگهجي، تنهنڪري هن ٽيڪنالاجي ۾ اعليٰ خصوصيت ۽ حساسيت آهي.

(2) NASBA سڌي طرح ريورس ٽرانسپشن جي عمل کي ايمپليفڪيشن جي رد عمل ۾ شامل ڪري ٿو، رد عمل جي وقت کي مختصر ڪري ٿو.

NASBA جا نقصان:

(1) ردعمل جا جزا وڌيڪ پيچيده آهن.

(2) رد عمل جي قيمت کي وڌيڪ ڪرڻ لاءِ ٽن قسمن جي اينزائمز جي ضرورت پوندي آهي.