Ct قدر فلورسنٽ مقداري PCR جو سڀ کان اهم نتيجو پيش ڪرڻ وارو فارم آهي.اهو جيني اظهار جي فرق يا جين ڪاپي نمبر جي حساب سان استعمال ڪيو ويندو آهي.پوءِ fluorescence quantification جي Ct قدر کي مناسب سمجھيو وڃي ٿو؟Ct قدر جي اثرائتي حد کي ڪيئن يقيني بڻايو وڃي؟
Ct قدر ڇا آهي؟
qPCR ايمپليفڪيشن جي عمل دوران، ايمپليفڪيشن سائيڪلن جو لاڳاپيل نمبر (سائيڪل حد) جڏهن ايمپليفائيڊ پراڊڪٽ جو فلورسنس سگنل مقرر فلورسنس حد تائين پهچي ٿو.C جو مطلب آهي سائيڪل ۽ T جو مطلب آهي حد.آسان لفظ ۾، Ct قدر ان سلسلي جو تعداد آھي جنھن سان لاڳاپيل آھي جڏھن ابتدائي ٽيمپليٽ ايمپليفڪيشن qPCR ۾ مصنوعات جي ھڪڙي خاص مقدار تائين پھچندي آھي.نام نهاد "پراڊڪٽ جي هڪ خاص مقدار" بعد ۾ وڌيڪ وضاحت ڪئي ويندي.
Ct قدر ڇا ڪندو؟
1. Exponential amplification، ٽيمپليٽ جي رقم ۽ Ct قدر جي وچ ۾ تعلق
مثالي طور تي، qPCR ۾ جينز هڪ خاص تعداد جي چڪر کان پوءِ تيز رفتاري سان گڏ ڪيا ويندا آهن.پراڊڪٽس جي تعداد ۽ پراڊڪٽ جي مقدار جي وچ ۾ لاڳاپو آھي: وڌايل پيداوار جي رقم = شروعاتي ٽيمپليٽ رقم × (1+En) سائيڪلن جو تعداد.بهرحال، qPCR ردعمل هميشه هڪ مثالي صورتحال ۾ ناهي.جڏهن وڌايل پراڊڪٽ جو مقدار ”ڪجهه پراڊڪٽ جي رقم“ تائين پهچندو آهي، ته هن وقت چڪرن جو تعداد Ct قدر هوندو آهي، ۽ اهو وڌاءُ واري پيماني واري دور ۾ هوندو آهي.Ct جي قيمت ۽ شروعاتي ٽيمپليٽ جي مقدار جي وچ ۾ تعلق: ٽيمپليٽ جي Ct قدر ۽ ٽيمپليٽ جي شروعاتي ڪاپي نمبر جي لاگارٿم جي وچ ۾ ھڪڙو لڪير وارو تعلق آھي.ابتدائي ٽيمپليٽ ڪنسنٽريشن جيترو وڌيڪ هوندو، اوترو ئي ننڍو Ct قدر؛شروعاتي ٽيمپليٽ جي ڪنسنٽريشن جيتري گھٽ هوندي، اوتري وڏي Ct قدر.
2.Amplification وکر، fluorescence حد ۽ ڪجهه PCR پيداوار جي رقم
qPCR امپليڪشن پراڊڪٽ جو مقدار سڌو سنئون فلورسنٽ سگنل جي صورت ۾ پيش ڪيو ويو آهي، اهو آهي، ايمپليفڪيشن وکر.PCR جي شروعاتي اسٽيج ۾، ايمپليفڪيشن مثالي حالتن ۾ آهي، چڪر جو تعداد ننڍڙو آهي، پيداوار جو جمع ننڍڙو آهي، ۽ فلورسنس جي سطح واضح طور تي فلوروسنس پس منظر کان فرق نه ٿو ڪري سگهجي.ان کان پوء، فلوروسنس وڌائي ٿو ۽ تيزيء واري مرحلي ۾ داخل ٿئي ٿو.پي سي آر پراڊڪٽ جي مقدار کي هڪ خاص نقطي تي معلوم ڪري سگهجي ٿو جڏهن پي سي آر جو رد عمل صرف اسپينيشنل مرحلي ۾ هوندو آهي، جنهن کي استعمال ڪري سگهجي ٿو ”پراڊڪٽ جي هڪ خاص مقدار“، ۽ ٽيمپليٽ جي شروعاتي مواد کي ان مان اندازو لڳائي سگهجي ٿو.تنهن ڪري، fluorescence سگنل جي شدت هڪ خاص مقدار جي پيداوار سان ملندڙ جلندڙ فلورسنس حد آهي.
PCR جي آخري مرحلي ۾، ايمپليفڪيشن وکر وڌيڪ نه ڏيکاريندو آهي ايڪسپونشنل ايمپليفڪيشن، ۽ داخل ٿئي ٿو لڪير واري مرحلي ۽ پليٽي مرحلي ۾.
3. Ct قدرن جي پيداواري صلاحيت
جڏهن PCR چڪر Ct قدر جي چڪر نمبر تي پهچي ٿو، اهو صرف صحيح ايڪسپورنشنل ايمپليفڪيشن دور ۾ داخل ٿيو آهي.هن وقت، ننڍڙي غلطي کي وڌايو ويو نه آهي، تنهنڪري Ct قدر جي ٻيهر پيداوار شاندار آهي، اهو آهي، ساڳئي ٽيمپليٽ مختلف وقتن تي يا مختلف ٽيوبن ۾ هڪ ئي وقت تي وڌايو ويندو آهي.واڌارو، حاصل ڪيل Ct قدر مسلسل آھي.
1.Amplification ڪارڪردگي En
پي سي آر ايمپليفڪيشن ڪارڪردگيءَ مان مراد اها ڪارڪردگي آهي جنهن سان پوليميرس جين کي ايمپليڪن ۾ تبديل ڪري ٿو.جڏهن هڪ ڊي اين اي ماليڪيول کي ٻن ڊي اين اي ماليڪيولن ۾ تبديل ڪيو وڃي ٿو ته ان کي وڌائڻ جي ڪارڪردگي 100٪ آهي.وڌائڻ جي ڪارڪردگي عام طور تي بيان ڪئي وئي آهي En.ايندڙ مضمونن جي تجزيي کي آسان ڪرڻ لاء، فڪر کي متاثر ڪرڻ واري ڪارڪردگي کي مختصر طور تي متعارف ڪرايو ويو آهي.
| متاثر ڪندڙ عنصر | وضاحت | فيصلو ڪيئن ڪجي؟ |
| A. PCR inhibitors | 1. ٽيمپليٽ ڊي اين اي ۾ مواد شامل آهن جيڪي پي سي آر جي رد عمل کي روڪيندا آهن، جهڙوڪ پروٽين يا ڊٽرجنٽ.2. ريورس ٽرانسڪرپشن کان پوءِ سي ڊي اين اي ۾ ٽيمپليٽ آر اين اي يا آر ٽي ريگينٽ اجزاء جو هڪ وڏو ڪنسنٽريشن هوندو آهي، جيڪو شايد ايندڙ PCR رد عمل کي به روڪي سگهي ٿو. | 1. آلودگي جو اندازو لڳائي سگھجي ٿو A260/A280 ۽ A260/A230 جي تناسب يا RNA الیکٹروفورسس جي ماپ سان.2. ڇا سي ڊي اين اي کي ريورس ٽرانسڪرپشن کان پوءِ هڪ خاص تناسب مطابق ٺهيو وڃي ٿو. |
| B. غلط پرائمر ڊيزائن | پرائمر موثر انداز ۾ anneal نه ڪندا آھن | پرائمر-dimers يا hairpins لاء پرائمر چيڪ ڪريو, بي ترتيب, ۽ ڪڏهن ڪڏهن spanning intronic ڊيزائن. |
| C. غلط PCR ردعمل پروگرام ڊيزائن | 1. پرائمر مؤثر طريقي سان anneal نٿا ڪري سگهن2. ڊي اين اي پوليمريز جي ناقص رليز 3. ڊگھي مدت جي اعلي درجه حرارت ڊي اين اي پوليميرس سرگرمي گھٽجي وئي | 1. annealing گرمي پد پرائمر جي TM قدر کان وڌيڪ آهي2. قبل از تاريخ وقت تمام ننڍو آهي 3. رد عمل جي عمل جي هر مرحلي جو وقت تمام ڊگهو آهي |
| D. ريجينٽس يا پائپنگ جي غلطين جي غير مناسب ميلاپ | رد عمل واري نظام ۾، پي سي آر جي رد عمل جي اجزاء جي مقامي ڪنسنٽريشن تمام گهڻي يا اڻ برابري آهي، جنهن جي نتيجي ۾ پي سي آر امپليفڪيشن جي غير اضطراري واڌارو آهي. | |
| E. ايمپليڪون ڊگھائي | amplicon جي ڊيگهه تمام ڊگھي آھي، 300bp کان وڌيڪ آھي، ۽ ايمپليفڪيشن ڪارڪردگي گھٽ آھي | چيڪ ڪريو ته ايمپليڪن جي ڊيگهه 80-300bp جي وچ ۾ آهي |
| F. qPCR ريجنٽس جو اثر | ريجنٽ ۾ ڊي اين اي پوليمريز جو ڪنسنٽريشن گهٽ هوندو آهي يا بفر ۾ آئنز جو ڪنسنٽريشن بهتر نه هوندو آهي، جنهن جي نتيجي ۾ Taq اينزائم سرگرمي وڌ کان وڌ نه پهچندي آهي. | معياري وکر جي ذريعي وڌائڻ جي ڪارڪردگي جو تعين |
2. Ct قدرن جي حد
Ct قدر 15-35 جي حد تائين.جيڪڏهن Ct قدر 15 کان گهٽ آهي، اهو سمجهيو وڃي ٿو ته واڌارو بيس لائين دور جي حد جي اندر آهي ۽ فلورسنس جي حد تائين پهچي نه سگهيو آهي.مثالي طور تي، Ct قدر ۽ ٽيمپليٽ جي شروعاتي ڪاپي نمبر جي لاگارٿم جي وچ ۾ ھڪڙو لڪير تعلق آھي، اھو آھي، معياري وکر.معياري وکر جي ذريعي، جڏهن وڌائڻ جي ڪارڪردگي 100٪ آهي، جين جي واحد ڪاپي نمبر جي مقدار جي حساب سان Ct قيمت لڳ ڀڳ 35 آهي. جيڪڏهن اهو 35 کان وڌيڪ آهي، ٽيمپليٽ جو ابتدائي ڪاپي نمبر نظرياتي طور تي 1 کان گهٽ آهي، جنهن کي بي معني سمجهي سگهجي ٿو.
مختلف جين Ct جي حدن لاءِ، جين ڪاپي نمبر ۾ فرق جي ڪري ۽ ابتدائي ٽيمپليٽ جي مقدار ۾ واڌارو ڪرڻ جي ڪارڪردگيءَ جي ڪري، ضروري آهي ته جين لاءِ هڪ معياري وکر ٺاهيو وڃي ۽ جين جي لڪير جي ڳولا واري حد کي ڳڻيو وڃي.
3. Ct قدر جا عنصر متاثر ڪن ٿا
ايمپليفڪيشن سائيڪلن جي تعداد ۽ پيداوار جي مقدار جي وچ ۾ تعلق کان: پراڊڪٽ جي مقدار = شروعاتي ٽيمپليٽ جي مقدار × (1+En) چڪر نمبر، اهو ڏسي سگھجي ٿو ته مثالي حالتن ۾، ابتدائي ٽيمپليٽ ۽ En جي مقدار تي منفي اثر ٿيندو Ct قدر تي اثر انداز ٿيندو.ٽيمپليٽ جي معيار يا امپليڪشن ڪارڪردگي ۾ فرق Ct قدر تمام وڏو يا تمام ننڍو ٿيندو.
4.Ct قدر تمام وڏو يا تمام ننڍو آهي
پوسٽ جو وقت: فيبروري-22-2023
