ماليڪيولر تشخيص ٽيڪنالاجي انساني جسم جي جينياتي مواد جي اظهار ۽ ساخت ۽ مختلف پيٿوجنز کي معلوم ڪرڻ لاءِ ماليڪيولر حياتيات جا طريقا استعمال ڪري ٿي، جيئن بيمارين جي اڳڪٿي ۽ تشخيص جو مقصد حاصل ڪري سگهجي.

تازن سالن ۾، ماليڪيولر تشخيصي ٽيڪنالاجي جي اپ گريڊيشن ۽ ورهاڱي سان، ماليڪيولر تشخيص جي ڪلينڪ ايپليڪيشن وڌيڪ ۽ وڌيڪ وسيع ۽ کوٽائي ٿي چڪي آهي، ۽ ماليڪيولر تشخيص مارڪيٽ تيز رفتار ترقي جي دور ۾ داخل ٿي چڪو آهي.

ليکڪ مارڪيٽ تي عام ماليڪيولر تشخيصي ٽيڪنالاجي جو خلاصو بيان ڪري ٿو، ۽ ٽن حصن ۾ ورهايل آهي: پهريون حصو پي سي آر ٽيڪنالاجي متعارف ڪرايو، ٻيو حصو نيوڪليڪ ايسڊ آئيسوٿرمل ايمپليفڪيشن ٽيڪنالاجي متعارف ڪرايو، ۽ ٻيو حصو تسلسل ٽيڪنالاجي متعارف ڪرايو.

01

حصو I: پي سي آر ٽيڪنالاجي

PCR ٽيڪنالاجي

PCR (Polymerase chain Reaction) هڪ ان ويٽرو ڊي اين اي ايمپليفڪيشن ٽيڪنالاجيز مان هڪ آهي، جنهن جي تاريخ 30 سالن کان وڌيڪ آهي.

پي سي آر ٽيڪنالاجي کي 1983 ۾ ڪيري موليس آف سيٽس، يو ايس اي پاران پيش ڪيو ويو.موليس 1985 ۾ پي سي آر پيٽنٽ لاءِ درخواست ڏني ۽ ساڳئي سال سائنس تي پهريون پي سي آر اڪيڊمڪ پيپر شايع ڪيو.موليس 1993 ۾ ڪيمسٽري ۾ نوبل انعام حاصل ڪيو.

PCR جا بنيادي اصول

PCR ٽارگيٽ ڊي اين اي جي ٽڪرن کي هڪ ملين کان وڌيڪ ڀيرا وڌائي سگھي ٿو.اصول اهو آهي ته ڊي اين اي پوليمريز جي ڪيٽيليسس جي تحت، پيرن اسٽرينڊ ڊي اين اي کي ٽيمپليٽ طور استعمال ڪيو ويندو آهي، ۽ هڪ مخصوص پرائمر کي واڌ جي شروعاتي نقطي طور استعمال ڪيو ويندو آهي.اهو ويٽرو ۾ نقل ڪيو ويو آهي قدمن ذريعي جيئن ته ٺهڪندڙ، اينيلنگ، ۽ واڌ.ڌيءَ اسٽرينڊ ڊي اين اي جو عمل پيرن اسٽرينڊ ٽيمپليٽ ڊي اين اي سان پورو ڪري ٿو.

معياري PCR عمل ٽن مرحلن ۾ ورهايل آهي:

1. Denaturation: DNA ڊبل اسٽرينڊ کي الڳ ڪرڻ لاءِ اعليٰ درجه حرارت استعمال ڪريو.ڊي اين اي ڊبل اسٽريڊس جي وچ ۾ هائڊروجن بانڊ تيز گرمي پد (93-98 ° سي) تي ڀڄي ويندا آهن.

2. اينيلنگ: ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي جي الڳ ٿيڻ کان پوءِ، گرمي پد کي گهٽايو ويندو آهي ته جيئن پرائمر هڪل اسٽرينڊ ڊي اين اي سان جڙي سگهي.

3. ايڪسٽينشن: ڊي اين اي پوليمريز ڊي اين اي اسٽريڊس سان گڏ مڪمل ڪرڻ واري اسٽريڊس کي پرائمر جي پابندن مان ٺهڪائڻ شروع ڪري ٿو جڏهن درجه حرارت گهٽجي وڃي ٿي.جڏهن توسيع مڪمل ٿئي ٿي، هڪ چڪر مڪمل ٿي ويو آهي، ۽ ڊي اين اي ٽڪرن جو تعداد ٻيڻو ٿي ويندو آهي.

انهن ٽنهي مرحلن کي 25-35 ڀيرا ورجائڻ سان، ڊي اين اي جي ٽڪرن جو تعداد تيزيءَ سان وڌي ويندو.

PCR جي آساني اها آهي ته مختلف پرائمر مختلف ٽارگيٽ جينز لاءِ ٺاهي سگهجن ٿا، ته جيئن ٽارگيٽ جين جي ٽڪرن کي ٿوري وقت ۾ وڌائي سگهجي.

هينئر تائين، پي سي آر کي ٽن ڀاڱن ۾ ورهائي سگهجي ٿو، يعني عام پي سي آر، فلورسنٽ مقداري پي سي آر ۽ ڊجيٽل پي سي آر.

عام PCR جو پهريون نسل

ٽارگيٽ جين کي وڌائڻ لاءِ هڪ عام پي سي آر ايمپليفڪيشن اوزار استعمال ڪريو، ۽ پوءِ پراڊڪٽ کي ڳولڻ لاءِ ايگرز جيل الیکٹروفورسس استعمال ڪريو، صرف معيار جو تجزيو ڪري سگهجي ٿو.

پهرين نسل جي PCR جا بنيادي نقصان:

- غير مخصوص واڌارو ۽ غلط مثبت نتيجن جي ڪري.

-تشخيص هڪ ڊگهو وقت وٺندو آهي ۽ آپريشن مشڪل آهي.

- صرف معيار جي جاچ ڪري سگهجي ٿي.

ٻيو نسل فلورسنس مقداري پي سي آر

fluorescence quantitative PCR (Real-Time PCR)، جيڪو پڻ qPCR جي نالي سان سڃاتو وڃي ٿو، استعمال ڪيو ويندو آهي فلورسنٽ سگنلن جي جمع ذريعي ايمپليفائيڊ شين جي جمع کي مانيٽر ڪرڻ لاءِ فلورسنٽ پروبس شامل ڪري جيڪي رد عمل واري نظام جي ترقي جي نشاندهي ڪري سگھن ٿا، ۽ نتيجن کي فيصلو ڪرڻ لاءِ فلورسنس وکر جي ذريعي، ۽ سي جي مدد سان معياري ٿي سگهي ٿو.

ڇاڪاڻ ته qPCR ٽيڪنالاجي هڪ بند سسٽم ۾ ڪئي ويندي آهي، آلودگي جو امڪان گهٽجي ويندو آهي، ۽ فلورسنس سگنل کي مقدار جي چڪاس لاءِ مانيٽر ڪري سگهجي ٿو، تنهنڪري اهو سڀ کان وڏي پيماني تي ڪلينڪل عملي ۾ استعمال ٿيندو آهي ۽ PCR ۾ غالب ٽيڪنالاجي بڻجي چڪو آهي.

حقيقي وقت فلورسنٽ مقداري پي سي آر ۾ استعمال ٿيندڙ فلورسنٽ مواد کي ورهائي سگھجي ٿو: TaqMan فلورسنٽ پروبس، ماليڪيولر بيڪنز ۽ فلورسنٽ رنگ.

1) TaqMan فلورسنٽ تحقيق:

PCR وڌائڻ دوران، هڪ خاص فلورسنٽ پروب شامل ڪيو ويو آهي جڏهن ته پرائمر جو هڪ جوڙو شامل ڪيو ويو آهي.تحقيق هڪ oligonucleotide آهي، ۽ ٻنهي سرن کي ترتيب سان هڪ رپورٽر فلورسنٽ گروپ ۽ هڪ quencher فلورسنٽ گروپ سان ليبل ڪيو ويو آهي.

جڏهن پروب برقرار آهي، رپورٽر گروپ پاران خارج ٿيل فلورسنٽ سگنل quenching گروپ پاران جذب ڪيو ويندو آهي؛PCR ايمپليفڪيشن جي دوران، Taq اينزائم جي 5′-3′ Exonuclease سرگرمي جاچ کي ختم ڪري ٿي ۽ ان کي خراب ڪري ٿي، رپورٽر فلورسنٽ گروپ ۽ quencher فلورسنٽ گروپ کي الڳ ڪيو ويو آهي، ته جيئن فلورسنس مانيٽرنگ سسٽم فلورسنس سگنل وصول ڪري سگهي، يعني، هر دفعي هڪ ايم اين اي فلو ۽ ايم اين اي فلو آهي. فلورسنس سگنل جي جمع مڪمل طور تي PCR پيداوار جي ٺهڻ سان هم وقت سازي ڪئي وئي آهي.

2) SYBR فلورسنٽ رنگ:

PCR ردعمل سسٽم ۾، SYBR فلورسنٽ رنگ جي اضافي شامل ڪئي وئي آهي.SYBR فلورسنٽ ڊائي کان پوءِ غير خاص طور تي ڊي اين اي ڊبل اسٽرينڊ ۾ شامل ڪيو ويو آهي، اهو هڪ فلورسنٽ سگنل خارج ڪري ٿو.SYBR ڊائي ماليڪيول جنهن کي زنجير ۾ شامل نه ڪيو ويو آهي اهو ڪنهن به فلورسنٽ سگنل کي خارج نه ڪندو، ان ڪري فلورسنٽ سگنل کي يقيني بڻائيندو PCR پروڊڪٽس ۾ اضافو مڪمل طور تي PCR مصنوعات جي واڌ سان هم وقت سازي ڪئي وئي آهي.SYBR صرف ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي سان جڙيل آهي، تنهن ڪري پگھلڻ وارو وکر اهو طئي ڪرڻ لاءِ استعمال ڪري سگهجي ٿو ته ڇا PCR ردعمل مخصوص آهي.

3) ماليڪيولر بيڪن

اهو هڪ اسٽيم-لوپ ڊبل-ليبل ٿيل oligonucleotide پروب آهي جيڪو 5 ۽ 3 سرن تي لڳ ڀڳ 8 بنيادن جي بال جي پنن جي جوڙجڪ ٺاهي ٿو.ٻنهي سرن تي نيوڪليڪ ايسڊ جي ترتيبن کي مڪمل طور تي جوڙيو ويو آهي، جنهن جي ڪري فلوروسنٽ گروپ ۽ quenching گروپ تنگ ٿي وڃي ٿو.بند ڪريو، اهو fluorescence پيدا نه ٿيندو.

PCR پراڊڪٽ جي پيدا ٿيڻ کان پوء، اينيلنگ جي عمل دوران، ماليڪيولر بيڪن جي وچ واري حصي کي هڪ مخصوص ڊي اين اي تسلسل سان جوڙيو ويندو آهي، ۽ فلوروسنٽ جين کي fluorescence پيدا ڪرڻ لاء quencher جين کان جدا ڪيو ويندو آهي.

ٻئين نسل جي PCR جا بنيادي نقصان:

حساسيت اڃا به گهٽ آهي، ۽ گهٽ ڪاپي جي نمونن جو پتو درست ناهي.

اتي پس منظر قدر جو اثر آھي، ۽ نتيجو مداخلت لاء حساس آھي.

ٽيون نسل ڊجيٽل پي سي آر

ڊجيٽل پي سي آر (ڊجيٽل پي سي آر، ڊي پي سي آر، ڊيگ-پي سي آر) آخري پوائنٽ جي چڪاس ذريعي ٽارگيٽ جي ترتيب جي ڪاپي نمبر کي ڳڻائي ٿو، ۽ اندروني ڪنٽرول ۽ معياري وکر استعمال ڪرڻ کان سواء درست مطلق مقدار جي چڪاس انجام ڏئي سگھي ٿو.

ڊجيٽل پي سي آر آخري پوائنٽ جي سڃاڻپ کي استعمال ڪري ٿو ۽ Ct قدر (سائيڪل جي حد) تي منحصر نه آهي، تنهنڪري ڊجيٽل پي سي آر رد عمل امپليفڪيشن ڪارڪردگي کان گهٽ متاثر ٿئي ٿو، ۽ پي سي آر جي رد عمل جي روڪٿام کي رواداري بهتر آهي، اعلي درستگي ۽ ٻيهر پيداوار سان.

اعلي حساسيت ۽ اعلي درستگي جي خاصيتن جي ڪري، اهو آساني سان PCR رد عمل جي مداخلت جي مداخلت نه آهي، ۽ اهو معياري مصنوعات جي بغير صحيح مطلق مقدار حاصل ڪري سگهي ٿو، جيڪو هڪ تحقيق ۽ ايپليڪيشن هٽ اسپاٽ بڻجي چڪو آهي.

ردعمل يونٽ جي مختلف شڪلن جي مطابق، ان کي ٽن قسمن ۾ ورهائي سگھجي ٿو: مائڪرو فلائيڊڪ، چپ ۽ بوند سسٽم.