شروعاتي مواد: آر اين اي
مقداري ريورس ٽرانسڪرپشن PCR (RT-qPCR) ھڪڙو تجرباتي طريقو آھي جيڪو پي سي آر تجربن ۾ استعمال ڪيو ويندو آھي آر اين اي کي شروعاتي مواد طور استعمال ڪندي.هن طريقي ۾، ڪل آر اين اي يا ميسينجر آر اين اي (ايم آر اين اي) پهريون ڀيرو مڪمل طور تي ڊي اين اي (سي ڊي اين اي) ۾ ريورس ٽرانسڪرپٽ ذريعي منتقل ڪيو ويو آهي.تنهن کان پوء، هڪ qPCR رد عمل ڪيو ويو سي ڊي اين اي کي ٽيمپليٽ طور استعمال ڪندي.RT-qPCR مختلف قسم جي ماليڪيولر حياتيات جي ايپليڪيشنن ۾ استعمال ڪيو ويو آهي، جن ۾ جيني اظهار جو تجزيو، آر اين اي مداخلت جي تصديق، مائڪروريري جي تصديق، پيٿوجين جي سڃاڻپ، جينياتي جانچ، ۽ بيماري جي تحقيق شامل آهن.
RT-qPCR لاءِ هڪ-قدم ۽ ٻه-قدم طريقا
RT-qPCR هڪ قدم يا ٻه-قدم طريقي سان پورو ڪري سگهجي ٿو.هڪ-قدم RT-qPCR ريورس ٽرانسڪرپشن ۽ پي سي آر ايمپليفڪيشن کي گڏ ڪري ٿو، ريورس ٽرانسڪرپٽ ۽ ڊي اين اي پوليمريز کي ساڳئي بفر حالتن ۾ ساڳئي ٽيوب ۾ رد عمل مڪمل ڪرڻ جي اجازت ڏئي ٿو.هڪ قدم RT-qPCR صرف ترتيب جي مخصوص پرائمر جي استعمال جي ضرورت آهي.ٻن قدمن ۾ RT-qPCR، ريورس ٽرانسپشن ۽ پي سي آر ايمپليفڪيشن ٻن ٽيوبن ۾، مختلف اصلاحي بفرز، رد عمل جي حالتن، ۽ پرائمر ڊيزائن جي حڪمت عملي کي استعمال ڪندي.
| فائدو | ناانصافي | |
| هڪ قدم | ھن طريقي ۾ گھٽ تجرباتي نقص آھي ڇاڪاڻ ته ٻئي رد عمل ھڪڙي ٽيوب ۾ ڪيا ويندا آھن
ٿورڙي پائپنگ جا قدم آلودگي جي خطري کي گھٽائي ٿو
موزون تيز-ذريعي ايمپليفڪيشن/اسڪريننگ، تيز ۽ ٻيهر پيدا ڪرڻ لاءِ | ٻن قدمن جي رد عمل کي الڳ الڳ نه ٿو ڪري سگهجي
جيئن ته رد عمل جون حالتون ٻن قدمن واري رد عمل کي گڏ ڪرڻ سان سمجهوتو ڪيون وينديون آهن، حساسيت ايتري سٺي نه هوندي آهي جيترو ٻن قدمن واري طريقي جي.
ھڪڙي نموني جي نشاندهي ڪيل ھدف جو تعداد ننڍڙو آھي |
| ٻه قدم | مستحڪم cDNA لائبريريون ٺاهڻ جي صلاحيت جيڪا ڊگهي عرصي تائين محفوظ ٿي سگهي ٿي ۽ ڪيترن ئي رد عمل ۾ استعمال ٿي سگهي ٿي
ھدف جين ۽ حوالن جين کي ھڪڙي ئي سي ڊي اين اي لائبريري مان وڌائي سگھجي ٿو بغير گھڻن سي ڊي اين اي لائبريرين جي ضرورت کان سواء
رد عمل بفر ۽ رد عمل جون حالتون جيڪي ھڪڙي رد عمل جي رن جي اصلاح کي چالو ڪن ٿيون
محرڪ حالتن جي لچڪدار چونڊ | گھڻن ٽيوب استعمال ڪرڻ، ۽ وڌيڪ پائپنگ جا قدم ڊي اين اي آلودگي جو خطرو وڌائي ٿو، ۽ وقت وٺندڙ.
ھڪڙي قدم واري طريقي کان وڌيڪ اصلاح جي ضرورت آھي |
لاڳاپيل مصنوعات:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (هڪ قدم)-SYBR گرين I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (هڪ قدم) - Taqman
RT Easyᴹ I Master Premix For First-Strand CDNA Synthesis
حقيقي وقت PCR Easyᵀᴹ-SYBR گرين I کٽ
ڪل RNA ۽ mRNA جو انتخاب
جڏهن هڪ RT-qPCR تجربو ٺاهيو، اهو فيصلو ڪرڻ ضروري آهي ته ڪل RNA استعمال ڪجي يا صاف ٿيل mRNA کي ريورس ٽرانسپشن لاءِ ٽيمپليٽ طور.جيتوڻيڪ mRNA ٿورڙي وڌيڪ حساسيت مهيا ڪرڻ جي قابل ٿي سگھي ٿو، مجموعي RNA اڃا تائين استعمال ڪيو ويندو آهي.ان جو سبب اهو آهي ته ڪل آر اين اي کي ايم آر اين اي جي ڀيٽ ۾ شروعاتي مادي طور وڌيڪ اهم فائدو حاصل آهي.پهرين، عمل کي صاف ڪرڻ جي گهٽ قدمن جي ضرورت آهي، جيڪا ٽيمپليٽ جي بهتر مقدار جي وصولي کي يقيني بڻائي ٿي ۽ سيل نمبرن کي شروع ڪرڻ لاءِ نتيجن جي بهتر معمول کي يقيني بڻائي ٿي.ٻيو، اهو mRNA جي افزودگي واري قدم کان پاسو ڪري ٿو، جيڪو مختلف mRNAs جي مختلف بحالي جي ڪري خراب نتيجن جي امڪان کان پاسو ڪري ٿو.مجموعي طور تي، ڇاڪاڻ ته اڪثر ايپليڪيشنن ۾ ٽارگيٽ جين جو لاڳاپو مقدار معلوم ڪرڻ جي مطلق حساسيت کان وڌيڪ اهم آهي، مجموعي طور تي RNA اڪثر ڪيسن ۾ وڌيڪ مناسب آهي.
ريورس ٽرانسپشن پرائمر
ٻن قدمن واري طريقي ۾، ٽي مختلف طريقا استعمال ڪري سگھجن ٿا سي ڊي اين اي ردعمل کي پرائمر ڪرڻ لاءِ: اوليگو (ڊي ٽي) پرائمر، بي ترتيب پرائمر، يا ترتيب سان مخصوص پرائمر.عام طور تي، oligo (dT) پرائمر ۽ بي ترتيب پرائمر ميلاپ ۾ استعمال ٿيندا آهن.اهي پرائمر ٽيمپليٽ mRNA اسٽرينڊ سان ڳنڍيندا آهن ۽ ترکیب لاءِ شروعاتي نقطي سان ريورس ٽرانسڪرپٽ مهيا ڪندا آهن.
| پرائمري جي چونڊ | ساخت ۽ فنڪشن | فائدو | ناانصافي |
| اوليگو (ڊي ٽي) پرائمر (يا اينڪر ٿيل اوليگو (ڊي ٽي) پرائمر) | mRNA جي پولي(A) دم تي ٿائمين جي باقيات کي وڌايو ويو؛اينڪر اوليگو (ڊي ٽي) پرائمر ۾ 3′ آخر ۾ G، C، يا A شامل آهي (لنگر سائيٽ) | پولي (A)-tailed mRNA مان پوري ڊگھي سي ڊي اين اي جو ٺهڪندڙ
قابل اطلاق جڏهن گهٽ شروعاتي مواد موجود آهي
اينڪرنگ سائيٽ يقيني بڻائي ٿي ته اوليگو (ڊي ٽي) پرائمر mRNA جي 5′ پولي (A) دم سان جڙيل آهي | صرف پولي (A) دم سان جين کي وڌائڻ لاءِ مناسب
حاصل ڪريو سي ڊي اين اي ٽرنڪٽ ٿيل پرائمنگ سائٽ *2 پولي (اي) ۾
3′ آخر تائين پابند ٿيڻ لاءِ باصلاحيت*
* اهو امڪان گهٽجي ويندو آهي جيڪڏهن لنگر ٿيل اوليگو (ڊي ٽي) پرائمر استعمال ڪيا وڃن |
| بي ترتيب پرائمر
| ڊگھائي ۾ 6 کان 9 بيسز، جيڪي آر اين اي ٽرانسپشن دوران ڪيترن ئي سائيٽن کي ڳنڍي سگھن ٿا | سڀني آر اين ايز (tRNA، rRNA، ۽ mRNA) کي ملائڻ
مناسب ثانوي ڍانچي سان ٽرانسڪرپٽس لاءِ، يا جڏھن گھٽ شروعاتي مواد موجود ھجي
اعلي سي ڊي اين جي پيداوار | سي ڊي اين اي سڀني آر اين اي مان ريورس ٽرانسڪرائب ٿيل آهي، جيڪا عام طور تي گهربل نه هوندي آهي ۽ ٽارگيٽ ايم آر اين اي جي سگنل کي گهٽائي سگهي ٿي.
سي ڊي اين اي حاصل ڪريو |
| ترتيب سان مخصوص پرائمر | ڪسٽم پرائمر مخصوص mRNA جي ترتيبن کي ھدف ڪن ٿا | مخصوص cDNA لائبريري
حساسيت کي بهتر بنائڻ
ريورس qPCR پرائمر استعمال ڪندي | صرف ھڪڙي ٽارگيٽ جين جي ٺاھڻ تائين محدود آھي |
ريورس ٽرانسڪرپٽ
Reverse transcriptase هڪ اينزيم آهي جيڪو ڊي اين اي کي گڏ ڪرڻ لاء آر اين اي استعمال ڪري ٿو.ڪجهه ريورس ٽرانسڪرپٽس ۾ RNase سرگرمي هوندي آهي ۽ ٽرانسڪرپشن کانپوءِ RNA-DNA هائبرڊ اسٽريڊس ۾ آر اين اي اسٽريڊس کي خراب ڪري سگهي ٿي.جيڪڏهن ان ۾ RNase enzymatic سرگرمي نه آهي، RNaseH اعلي qPCR ڪارڪردگي لاء شامل ڪري سگهجي ٿو.عام طور تي استعمال ٿيندڙ اينزائمز ۾ شامل آهن Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase ۽ avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.RT-qPCR لاءِ، اهو مثالي آهي ته هڪ ريورس ٽرانسڪرپٽيس کي اعليٰ حرارتي صلاحيت سان چونڊيو وڃي، ته جيئن سي ڊي اين اي سنٿيسس کي اعليٰ درجه حرارت تي انجام ڏئي سگهجي، اعليٰ ثانوي ڍانچي سان آر اين ايز جي ڪامياب ٽرانسڪرپشن کي يقيني بڻائي، پوري رد عمل ۾ انهن جي مڪمل سرگرمي کي برقرار رکندي، جنهن جي نتيجي ۾ سي ڊي اين اي جي پيداوار وڌيڪ ٿيندي.
لاڳاپيل مصنوعات:
ريورس ٽرانسڪرپٽ جي RNase H سرگرمي
RNaseH RNA-DNA ڊوپليڪسز مان آر اين اي اسٽريڊس کي ختم ڪرڻ جي قابل آهي، ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي جي موثر ترکیب جي اجازت ڏئي ٿي.تنهن هوندي، جڏهن ڊگھي mRNA کي ٽيمپليٽ طور استعمال ڪيو وڃي ٿو، RNA وقت کان اڳ خراب ٿي سگهي ٿو، نتيجي ۾ cDNA ڪٽيل آهي.تنهن ڪري، سي ڊي اين اي ڪلوننگ دوران RNaseH سرگرمي کي گھٽ ڪرڻ اڪثر فائديمند آهي جيڪڏهن ڊگهن ٽرانسڪرپٽس جي ٺهڻ جي خواهش هجي.ان جي ابتڙ، RNase H سرگرمي سان ريورس ٽرانسپيسس اڪثر ڪري qPCR ايپليڪيشنن لاءِ فائديمند هوندا آهن ڇاڪاڻ ته اهي PCR جي پهرين چڪر دوران RNA-DNA duplexes جي پگھلڻ کي وڌائيندا آهن.
پرائمر ڊيزائن
RT-qPCR ۾ qPCR قدم لاءِ استعمال ٿيندڙ PCR پرائمر کي مثالي طور تي exon-exon junction کي وڌائڻ لاءِ ڊزائين ڪيو وڃي، جتي هڪ ايمپليفڪيشن پرائمر ممڪن طور تي هڪ حقيقي exon-intron جي حد تائين وڌائي سگھي ٿو.جيئن ته intron تي مشتمل جينومڪ ڊي اين اي جي ترتيبن کي وڌايو نه ويو آهي، هي ڊزائن جينومڪ ڊي اين اي کي آلودگي کان وڌائي غلط مثبتات جي خطري کي گھٽائي ٿو.
جيڪڏهن پرائمر exons يا Exon-exon حدن کي الڳ ڪرڻ لاءِ ڊزائين نٿا ڪري سگهجن، ته ضروري ٿي سگهي ٿو ته آر اين اي نموني کي RNase-free DNase I يا dsDNase سان علاج ڪيو وڃي ته جيئن جينومڪ ڊي اين اي آلودگي کي ختم ڪيو وڃي.
RT-qPCR ڪنٽرول
هڪ ريورس ٽرانسڪرپشن منفي ڪنٽرول (-RT ڪنٽرول) سڀني RT-qPCR تجربن ۾ شامل ٿيڻ گهرجي ڊي اين اي آلودگي کي ڳولڻ لاء (جهڙوڪ جينومڪ ڊي اين اي يا پي سي آر پروڊڪٽس اڳئين رد عمل مان).هي ڪنٽرول سڀني ردعمل اجزاء تي مشتمل آهي سواء ريورس ٽرانسڪرپٽ.جيئن ته هن ڪنٽرول سان ريورس ٽرانسڪرپشن نه ٿي ٿئي، جيڪڏهن پي سي آر ايمپليفڪيشن جو مشاهدو ڪيو وڃي، ڊي اين اي مان آلودگي تمام گهڻو امڪان آهي.
پوسٽ جو وقت: آگسٽ-02-2022
