• فيسبوڪ
  • ڳنڍيل
  • يوٽيوب

ليبارٽري ۾ هڪ نئين جي طور تي، اهو سٺو ڪم نه آهي ته مثبت ٻوٽن جي ٻوٽن جي هڪ گروپ مان گهٽ تبديلي جي شرح سان اسڪريننگ ڪرڻ.سڀ کان پهرين، هڪ هڪ ڪري وڏي تعداد ۾ نمونن مان ڊي اين اي ڪڍڻو پوندو، ۽ پوءِ پي سي آر ذريعي غير ملڪي جين کي معلوم ڪيو ويندو.بهرحال، نتيجا اڪثر ڪري خالي هوندا آهن ۽ بينڊ ڪڏهن ڪڏهن ڪجهه شيون سان، پر اهو طئي ڪرڻ ناممڪن آهي ته ڇا گم ٿيل دريافتون آهن يا غلط دريافتون..ڇا اهڙي تجرباتي عمل ۽ نتيجن کي منهن ڏيڻ بلڪل بي وس آهي؟پريشان نه ٿيو، ڀاءُ توهان کي سيکاري ٿو ته ڪيئن آساني سان ۽ صحيح طور تي ٽرانسجنڪ مثبت ٻوٽن جي اسڪريننگ ڪجي.

قدم 1

ڊيزائن جي سڃاڻپ پرائمر

تيز 1

جانچ ڪرڻ لاءِ نمونن جي مطابق معلوم ٿيڻ لاءِ endogenous جين ۽ exogenous جين جو اندازو لڳايو، ۽ پرائمر ڊيزائن لاءِ جين ۾ نمائندو 100-500bp تسلسل چونڊيو.سٺا پرائمر ڳولڻ جي نتيجن جي درستگي کي يقيني بڻائي سگهن ٿا ۽ ڳولڻ جي وقت کي مختصر ڪري سگھن ٿا (عام طور تي استعمال ٿيل تشخيص پرائمر لاء ضميمه ڏسو).

نوٽ: نئين ڊزائين ڪيل پرائمر کي رد عمل جي حالتن کي بهتر ڪرڻ جي ضرورت آهي ۽ وڏي پيماني تي ڳولڻ کان اڳ ڳولڻ جي درستگي، درستگي ۽ ڳولڻ جي حد جي تصديق ڪرڻ جي ضرورت آهي.

قدم 2

ڊزائين تجرباتي پروٽوڪول

تيز 2

مثبت ڪنٽرول: صاف ٿيل ڊي اين اي استعمال ڪريو جنھن ۾ ھدف جي ٽڪرا ھڪڙي ٽيمپليٽ جي طور تي طئي ڪيو وڃي ته ڇا پي سي آر ردعمل سسٽم ۽ حالتون عام آھن.

ناڪاري/خالي ڪنٽرول: استعمال ڪريو DNA ٽيمپليٽ يا ddH2O جنهن ۾ ٽارگيٽ ٽڪرا شامل نه هجي ٽيمپليٽ جي طور تي اهو معلوم ڪرڻ لاءِ ته ڇا PCR سسٽم ۾ آلودگي جو ڪو ذريعو آهي.

اندروني حوالو ڪنٽرول: استعمال ڪريو پرائمر/پروب جي ميلاپ جي آخرت جي جين نموني جي جانچ ڪرڻ لاءِ جانچڻ لاءِ ته ڇا ٽيمپليٽ پي سي آر ذريعي ڳولي سگهجي ٿو.

نوٽيس:

مثبت، منفي/خالي ڪنٽرول ۽ اندروني ڪنٽرول ڪنٽرول هر ٽيسٽ لاءِ مقرر ڪيا وڃن ته جيئن تجرباتي نتيجن جي صحيحيت جو اندازو لڳايو وڃي.

تجربي جي تياري

تيز 3

استعمال ڪرڻ کان اڳ، ڏسو ته ڇا حل هڪجهڙائي سان ملايو ويو آهي.جيڪڏهن ورهاڱي ملي ٿي، ان کي استعمال ڪرڻ کان اڳ هدايتن جي مطابق تحلیل ۽ ملايو وڃي.2×PCR مکس کي پائپٽ ڪرڻ جي ضرورت آهي ۽ بار بار مائڪروپيپيٽ سان ملايو وڃي استعمال ڪرڻ کان اڳ غير برابر آئن ورڇ کان بچڻ لاءِ.

نوٽيس:

دستور مان ڪڍي وٺو ۽ ان کي غور سان پڙهو، ۽ تجربي کان اڳ تياري ڪريو دستي جي ضرورتن مطابق سختي سان.

قدم 4

PCR ردعمل سسٽم تيار ڪريو

تيز 4

تجرباتي پروٽوڪول جي مطابق، پرائمر، H2O، ۽ 2×PCR کي هڪجهڙائي سان ملايو، سينٽرفيوج ڪريو ۽ انهن کي هر رد عمل واري ٽيوب ۾ ورهايو.

نوٽيس:

وڏي پيماني تي يا ڊگهي مدت جي جاچ لاءِ، اها سفارش ڪئي وئي آهي ته PCR رد عمل وارو نظام استعمال ڪيو وڃي جنهن ۾ UNG اينزيم شامل آهي، جيڪو مؤثر طريقي سان پي سي آر جي شين جي ڪري ايروسول آلودگي کان بچي سگهي ٿو.

قدم 5

ردعمل ٽيمپليٽ شامل ڪريو

تيز 5

سڌو پي سي آر ٽيڪنالاجي استعمال ڪندي، سخت نيوڪليڪ ايسڊ صاف ڪرڻ واري عمل جي ڪا ضرورت ناهي، نموني ٽيمپليٽ 10 منٽن اندر تيار ٿي سگهي ٿو، ۽ لاڳاپيل پي سي آر ردعمل سسٽم شامل ڪري سگهجي ٿو.

نوٽيس:

صفائي جو طريقو بهتر ڳولڻ وارو اثر آهي، ۽ حاصل ڪيل پيداوار ڪيترن ئي ڳولڻ جي رد عمل لاء استعمال ڪري سگهجي ٿو.

تيز 6

5.1: پنن جي سڌي توسيع

دستي ۾ ڏنل تصوير جي ماپ مطابق، 2-3 ملي ميٽر جي قطر سان پتي جي ٽشو کي ڪٽيو ۽ ان کي PCR ردعمل سسٽم ۾ رکو.

نوٽ: پڪ ڪريو ته پنن جا ٽڪرا مڪمل طور تي پي سي آر جي رد عمل جي حل ۾ ڊهي ويا آهن، ۽ وڌيڪ پتي جي ٽشو شامل نه ڪريو.

5.2: ليف ورهائڻ جو طريقو

پتي جي ٽشو کي 5-7 ملي ميٽر جي قطر سان ڪٽيو ۽ ان کي سينٽرفيوج ٽيوب ۾ رکو.جيڪڏھن توھان پختو پنن کي چونڊيو، مھرباني ڪري پنن جي مکيه رگ جي ٽشوز کي استعمال ڪرڻ کان پاسو ڪريو.Pipette 50ul Buffer P1 lysate کي سينٽريفيوج ٽيوب ۾ وجھو ته جيئن lysate پتي جي ٽشو کي مڪمل طور تي وجھي سگھي، ان کي ٿرمل سائيلر يا ميٽل باٿ ۾ رکي، ۽ 5-10 منٽن لاءِ 95°C تي لڪايو.

تيز 7

50ul بفر P2 غير جانبدار حل شامل ڪريو ۽ چڱي طرح گڏ ڪريو.نتيجو lysate هڪ ٽيمپليٽ طور استعمال ڪري سگهجي ٿو ۽ PCR رد عمل سسٽم ۾ شامل ڪيو ويو.

نوٽ: ٽيمپليٽ جو مقدار PCR سسٽم جي 5-10٪ جي وچ ۾ آهي، ۽ 20٪ کان وڌيڪ نه هجڻ گهرجي (مثال طور، 20μl PCR سسٽم ۾، 1-2μl lysis حل شامل ڪريو، 4μl کان وڌيڪ نه).

قدم 6

PCR ردعمل

تيز 8

پي سي آر جي رد عمل واري ٽيوب کي سينٽرفيوگ ڪرڻ کان پوءِ، ان کي پي سي آر اوزار ۾ وڌاءُ لاءِ رکيو ويندو آهي.

نوٽيس:

رد عمل ايمپليفڪيشن لاءِ غير صاف ٿيل ٽيمپليٽ استعمال ڪري ٿو، تنهنڪري ايمپليفڪيشن سائيڪلن جو تعداد 5-10 وڌيڪ چڪر آهي جڏهن ته صاف ٿيل ڊي اين اي ٽيمپليٽ استعمال ڪرڻ جي ڀيٽ ۾.

قدم 7

اليڪٽرروفورسس ڳولڻ ۽ نتيجن جو تجزيو

تيز 9

M: 100bp DNA Ladder

1 \ 4: صاف ٿيل ڊي اين اي طريقو

2\5: سڌو PCR طريقو

3\6: خالي ڪنٽرول

QC:

تجربن ۾ مقرر ڪيل مختلف ڪنٽرولن جا امتحان جا نتيجا هيٺين شرطن کي پورا ڪرڻ گهرجن.ٻي صورت ۾، مسئلي جي سبب جو تجزيو ڪيو وڃي، ۽ مسئلو ختم ٿيڻ کان پوء ٻيهر ٽيسٽ ڪيو وڃي.

ٽيبل 1. مختلف ڪنٽرول گروپن جا عام امتحان جا نتيجا

*جڏهن پلازميڊ کي مثبت ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويندو آهي، انڊوجينس جين ٽيسٽ جو نتيجو منفي ٿي سگهي ٿو

نتيجو فيصلو:

A. نموني جي endogenous gene جو امتحان جو نتيجو ناڪاري آهي، جنهن مان ظاهر ٿئي ٿو ته DNA عام PCR جي چڪاس لاءِ موزون نموني مان ڪڍي نٿو سگهجي يا ڪڍيل DNA ۾ PCR ردعمل انابيٽرز شامل آهن، ۽ DNA کي ٻيهر ڪڍڻ گهرجي.

B. نموني جي endogenous جين جو امتحان جو نتيجو مثبت آهي، ۽ Exogenous جين جو امتحان جو نتيجو ناڪاري آهي، جنهن مان ظاهر ٿئي ٿو ته عام PCR جي چڪاس لاءِ مناسب ڊي اين اي نموني مان ڪڍيو ويو آهي، ۽ اهو اندازو لڳائي سگهجي ٿو ته نموني ۾ ايڪس اينڪس جين نه ملي آهي.

C. نموني جي endogenous gene جو امتحان جو نتيجو مثبت آهي، ۽ exogenous gene جو امتحان جو نتيجو مثبت آهي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته عام PCR جي چڪاس لاءِ مناسب DNA نموني مان ڪڍيو ويو آهي، ۽ نموني DNA ۾ XXX جين شامل آهي.تصديق جا تجربا اڳتي هلي سگهجن ٿا.

قدم 8

ڊيزائن جي سڃاڻپ پرائمر

تيز 10

تجربن کان پوء، ماحولياتي آلودگي کي روڪڻ لاء تجرباتي علائقي کي صاف ڪرڻ لاء 2٪ سوڊيم هائپو ڪلورائٽ حل ۽ 70٪ ايٿانول حل استعمال ڪريو.


پوسٽ ٽائيم: سيپٽمبر-08-2021