فلوروسينس مقداري پي سي آر (جنهن کي TaqMan PCR پڻ سڏيو ويندو آهي، ان کان پوءِ FQ-PCR طور حوالو ڏنو ويو آهي) هڪ نئين نيوڪلڪ ايسڊ مقداري ٽيڪنالاجي آهي جيڪا PE (Perkin Elmer) پاران 1995 ۾ آمريڪا ۾ ٺاهي وئي آهي. هي ٽيڪنالاجي فلورسنٽ ليبل ٿيل پروبي شامل ڪندي روايتي پي سي آر تي ٻڌل آهي.لچڪدار PCR جي مقابلي ۾، FQ-PCR وٽ ڪيترائي فائدا آھن ان جي مقداري ڪم کي محسوس ڪرڻ لاءِ.هي آرٽيڪل مختصر طور تي ٽيڪنالاجي جي خاصيتن، اصولن، طريقن ۽ ايپليڪيشنن کي بيان ڪرڻ جو ارادو رکي ٿو.

1 خاصيتون

FQ-PCR ۾ نه رڳو عام پي سي آر جي اعليٰ حساسيت آهي، پر فلورسنٽ پروبس جي استعمال جي ڪري، اهو مقداري نتيجا حاصل ڪرڻ لاءِ فوٽو اليڪٽرڪ ڪنڊڪشن سسٽم ذريعي پي سي آر ايمپليفڪيشن دوران فلورسنٽ سگنل جي تبديلي کي سڌو سنئون ڳولي سگهي ٿو، جيڪو روايتي پي سي آر جي ڪيترين ئي خامين کي دور ڪري ٿو، تنهنڪري ان ۾ پڻ اعليٰ معيار جي ڊي اين اي اسپيڪٽ ۽ اعليٰ معيار جي مخصوص ٽيڪنالاجي آهي.

مثال طور، عام پي سي آر پروڊڪٽس کي ڏسڻ جي ضرورت آهي agarose gel electrophoresis ۽ ethidium bromide staining with ultraviolet light or polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining.اهو نه رڳو ڪيترن ئي اوزارن جي ضرورت آهي، پر وقت ۽ ڪوشش پڻ وٺندو آهي.استعمال ٿيل داغ ايٿيڊيم برومائيڊ انساني جسم لاءِ نقصانڪار آهن، ۽ اهي پيچيده تجرباتي طريقا آلودگي ۽ غلط مثبتات جا موقعا فراهم ڪن ٿا.بهرحال، FQ-PCR کي نموني لوڊ ڪرڻ دوران صرف هڪ ڀيرو لڪ کي کولڻ جي ضرورت آهي، ۽ بعد وارو عمل مڪمل طور تي بند ٽيوب آپريشن آهي، جنهن ۾ PCR پوسٽ پروسيسنگ جي ضرورت ناهي، روايتي پي سي آر عملن ۾ ڪيترن ئي خرابين کان بچڻ.تجربو عام طور تي PE ڪمپني پاران تيار ڪيل ABI7100 PCR تھرمل سائيڪلر استعمال ڪري ٿو.

اوزار ۾ ھيٺيون خاصيتون آھن: ① وسيع ايپليڪيشن: اھو استعمال ڪري سگھجي ٿو ڊي اين اي ۽ آر اين اي پي سي آر جي پيداوار جي مقدار، جين ايڪسپريس ريسرچ، پيٿوجين جي سڃاڻپ، ۽ پي سي آر جي حالتن جي اصلاح لاءِ.② منفرد مقداري اصول: fluorescently ليبل ٿيل پروب استعمال ڪندي، فلوروسينس جو مقدار پي سي آر جي چڪر سان گڏ ليزر جي حوصلا افزائي کان پوء گڏ ٿيندو، جيئن مقدار جي مقصد کي حاصل ڪرڻ لاء.③ اعلي ڪم ڪندڙ ڪارڪردگي: بلٽ-ان 9600 پي سي آر تھرمل سائيڪلر، ڪمپيوٽر ڪنٽرول 1 کان 2 ڪلاڪ مڪمل ڪرڻ لاءِ 96 نمونن جي مقدار ۽ مقدار کي مڪمل ڪرڻ لاءِ خودڪار ۽ هم وقت سازي سان.④ جيل الیکٹروفورسس جي ضرورت ناهي: نموني کي گھٽائڻ ۽ اليڪٽرروفورسس ڪرڻ جي ڪا ضرورت ناهي، صرف ردعمل ٽيوب ۾ سڌو سنئون ڳولڻ لاء هڪ خاص تحقيق استعمال ڪريو.⑤پائپ لائن ۾ ڪو به آلودگي: منفرد مڪمل طور تي بند ٿيل رد عمل ٽيوب ۽ photoelectric conduction نظام کي منظور ڪيو ويو آهي، تنهنڪري آلودگي جي باري ۾ پريشان ٿيڻ جي ڪا ضرورت ناهي.⑥ نتيجا ٻيهر پيدا ڪرڻ وارا آهن: مقداري متحرڪ رينج پنجن آرڊرن جي شدت تائين آهي.تنهن ڪري، هن ٽيڪنالاجي جي ڪاميابيء سان ترقي ڪئي وئي آهي، ان کي ڪيترن ئي سائنسي محققن طرفان قدر ڪيو ويو آهي ۽ ڪيترن ئي شعبن ۾ لاڳو ڪيو ويو آهي.

2 اصول ۽ طريقا

FQ-PCR جو ڪم ڪندڙ اصول 5′→3′ Taq enzyme جي exonuclease سرگرمي کي استعمال ڪرڻ آهي ته جيئن پي سي آر جي رد عمل واري نظام ۾ فلوروسنٽ طور تي ليبل ٿيل پروب شامل ڪري سگهجي.پروب خاص طور تي پرائمر تسلسل ۾ موجود ڊي اين اي ٽيمپليٽ سان گڏ ڪري سگھي ٿو.جاچ جي 5′ پڇاڙيءَ تي فلوروسينس ايميشن جين FAM (6-carboxyfluorescein، 518nm تي fluorescence emition peak) سان ليبل لڳل آهي، ۽ 3′end کي The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxyetramethylrhodence)، 5′Carboxyetramethylrhodence 5. تحقيق جي شروعات فاسفوريليٽ ڪئي وئي آهي ته جيئن پي سي آر امپليفڪيشن دوران پروب کي وڌائڻ کان روڪي سگهجي.جڏهن پروب برقرار رهي ٿو، quencher گروپ خارج ڪندڙ گروپ جي فلوروسنس اخراج کي دٻائي ٿو.هڪ ڀيرو ايميٽنگ گروپ کي quenching گروپ کان الڳ ڪيو ويندو آهي، انبيشن کي هٽايو ويندو آهي، ۽ نظرياتي کثافت 518nm تي وڌي ويندي آهي ۽ ان کي فلورسنس ڊيٽڪشن سسٽم ذريعي معلوم ڪيو ويندو آهي. بحالي واري مرحلي ۾، پروب ڊي اين اي ٽيمپليٽ سان هائبرڊائيز ڪندو آهي، ۽ ايڪسٽينشن جي ڊي اين اي جي ايڪسٽينشن واري مرحلي ۾ Taq اينزائم سان گڏ وڌندي آهي.جڏهن تحقيق بند ٿي وئي آهي، quenching اثر ڇڏيل آهي ۽ فلورسنٽ سگنل جاري ڪيو ويو آهي.هر دفعي ٽيمپليٽ کي نقل ڪيو ويندو آهي، هڪ تحقيق کي ڪٽيو ويندو آهي، فلورسنٽ سگنل جي ڇڏڻ سان گڏ.جيئن ته آزاد ٿيل فلوروفورس جي تعداد ۽ پي سي آر شين جي تعداد جي وچ ۾ ھڪڙو تعلق آھي، ھن ٽيڪنڪ کي استعمال ڪري سگھجي ٿو ٽيمپليٽ کي صحيح انداز سان.تجرباتي اوزار عام طور تي PE ڪمپني پاران تيار ڪيل ABI7100 PCR تھرمل سائيڪلر استعمال ڪري ٿو، ۽ ٻيا تھرمل سائيڪل پڻ استعمال ڪري سگھجن ٿا.جيڪڏهن ABI7700 رد عمل جي قسم جو رد عمل سسٽم استعمال ڪيو ويندو آهي تجربو، رد عمل مڪمل ٿيڻ کان پوء، مقداري نتيجا سڌو سنئون ڪمپيوٽر جي تجزيي ذريعي ڏئي سگهجي ٿو.جيڪڏهن توهان ٻيا حرارتي سائيڪل استعمال ڪندا آهيو، توهان کي هڪ ئي وقت ۾ RQ+، RQ-، △RQ جي حساب سان رد عمل واري ٽيوب ۾ فلوروسينس سگنل کي ماپڻ لاءِ فلوروسينس ڊيڪٽر استعمال ڪرڻ جي ضرورت آهي.RQ+ نموني جي ٽيوب جي فلوروسنٽ اخراج گروپ جي luminescence شدت جي تناسب کي quenching گروپ جي luminescence شدت جي نمائندگي ڪري ٿو، RQ- خال ٽيوب ۾ ٻن جي تناسب جي نمائندگي ڪري ٿو، △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) نمائندگي ڪري ٿو PCR ڊيٽا جي مقدار کي تبديل ڪرڻ کان پوء، ڊيٽا جي مقدار کي تبديل ڪري سگھي ٿو. .فلورسنٽ پروبس جي تعارف جي ڪري، تجربي جي خاصيت کي خاص طور تي بهتر ڪيو ويو آهي.جاچ جي ڊيزائن کي عام طور تي هيٺين شرطن کي پورا ڪرڻ گهرجي: ① بائنڊنگ جي خاصيت کي يقيني بڻائڻ لاءِ جاچ جي ڊيگهه اٽڪل 20-40 بيس هجڻ گهرجي.②GC بيسز جو مواد 40% ۽ 60% جي وچ ۾ آهي ته جيئن سنگل نيوڪليوٽائيڊ تسلسل جي نقل کان بچڻ لاءِ.③ هائبرڊائيزيشن کان پاسو ڪريو يا پرائمر سان اوورليپ ڪريو.④ پروب ۽ ٽيمپليٽ جي وچ ۾ بائنڊنگ جي استحڪام پرائمر ۽ ٽيمپليٽ جي وچ ۾ بائنڊنگ جي استحڪام کان وڌيڪ آهي، تنهنڪري تحقيق جي Tm قدر گهٽ ۾ گهٽ هجڻ گهرجي 5 ° C پرائمر جي Tm قدر کان.ان کان علاوه، پروب جي ڪنسنٽريشن، پروب ۽ ٽيمپليٽ جي ترتيب جي وچ ۾ هومولوجي، ۽ پروب ۽ پرائمر جي وچ ۾ فاصلو سڀني جو اثر تجرباتي نتيجن تي آهي.

لاڳاپيل مصنوعات:

چائنا Lnc-RT Heroᵀᴹ I(GDNase سان)(Super Premix for first-strand cDNA synthesis from lncRNA) ٺاهيندڙ ۽ فراهم ڪندڙ |Foregene (foreivd.com)

چين حقيقي وقت پي سي آر Easyᵀᴹ-تقمان ٺاهيندڙ ۽ فراهم ڪندڙ |Foregene (foreivd.com)